人角膜緣微環(huán)境細胞表達干細胞因子的體外研究.pdf

1、【目的】探討人角膜緣微環(huán)境細胞（LNCs）是否表達干細胞因子(SCF）及SCF在LNC細胞增殖過程中的作用。
　　【方法】采用組織切片免疫熒光染色檢測人角膜緣組織中SCF及其受體C-kit的表達情況，其中以波形蛋白（vimentin）和pan cytokeratin(PCK)來區(qū)別基質及上皮組織。從人的角膜緣組織中分離培養(yǎng)人角膜緣微環(huán)境細胞(LNC)，以人骨髓來源的間充質干細胞（BMMSCs）為對照，采用流式細胞技術和熒光定量實時

2、PCR技術檢測其CD90，CD105，CD73及SCF表達情況；采用免疫印跡技術檢測SCF的表達量；采用免疫熒光技術檢測SCF的表達部位。利用攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的hSCF siRNA慢病毒載體,以不同感染復數(shù)（MOI）0,5,10,15,20,30,50感染LNC，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，確定最佳感染復數(shù)（MOI）值。以最佳感染復數(shù)，采用攜帶GFP的慢病毒感染LNC做SCFsiRNA實驗。實驗分為3組，分別為：LNC空

3、白組（CON組）、慢病毒感染LNC陰性對照組（NC組）、慢病毒感染LNC SCF siRNA組。采用熒光定量實時PCR（real-time PCR）和免疫印跡技術檢測 SCF siRNA的沉默效率。并采用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測各組LNC增殖活性變化。
　　【結果】人角膜緣組織切片免疫熒光染色結果顯示：SCF主要表達于PCK陽性細胞的基底層，其受體C-kit主要位于角膜緣組織的上皮層，而非基

4、底層。流式細胞技術結果顯示：96.73％的LNC表達CD90，88.71%的LNC表達CD105，95.02%的LNC表達CD73，11.06%的LNC表達SCF；而98.61%的BMMSC表達CD90，92.31%的BMMSC表達CD105，98.09%的BMMSC表達CD73，3.14%的BMMSC表達 SCF。熒光定量實時PCR結果從mRNA水平顯示：LNC和BMMSC細胞內表達CD90,CD73,CD105和SCF的含量無明顯差

5、異，而LNC細胞中vimentin,SOX2和POU5F的mRNA含量明顯高于BMMSC細胞。免疫印跡結果表明：LNC細胞中SCF的含量高于BMMSC。免疫熒光實驗結果顯示SCF主要表達于LNC和BMMSC的細胞膜和細胞質。攜帶綠色熒光蛋白（GFP）和hSCF siRNA的慢病毒,以不同感染復數(shù)感染LNC后，除MOI=0外其余MOI值條件下感染72h后LNC均有綠色熒光表達，但以MOI=5條件下LNC細胞生存狀態(tài)良好，且隨培養(yǎng)時間延長1