9種豬病病原體GeXP多重PCR檢測(cè)方法的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒二型、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、水皰性口炎病毒、豬水泡病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌以及豬胸膜肺炎放線桿菌等都是臨床上較為常見(jiàn)的，傳染性強(qiáng)、流行廣泛，且危害極為嚴(yán)重的豬病病原體，極大的影響并制約著我國(guó)的生豬養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，也對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生安全造成了巨大的隱患。這9種疫病常以混合感染的形式出現(xiàn)，臨床癥狀十分復(fù)雜，目前的檢測(cè)手段難以應(yīng)對(duì)。GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統(tǒng)是一種新型的多基因表達(dá)定量分析

2、平臺(tái)，將GeXP的多重PCR擴(kuò)增技術(shù)與毛細(xì)管電泳分析技術(shù)相結(jié)合，利用帶有熒光標(biāo)記的通用引物和特異性嵌合引物的聯(lián)合擴(kuò)增，使目的基因得到高效表達(dá)，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量及檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。
　　本研究根據(jù)NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列，對(duì)保守區(qū)基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，并設(shè)計(jì)9對(duì)特異性引物，利用常規(guī) PCR的單引物單模板和單引物混合模板的雙重

3、驗(yàn)證方式，對(duì)以上引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證分析；同時(shí)利用高效的pMD19-T Simple克隆載體構(gòu)建9種陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，應(yīng)用GeXP技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的引物均具有良好的特異性和敏感性，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果均與 GenBank所中公布靶基因序列相符，同源性達(dá)到99.5％以上。將9對(duì)特異性引物其進(jìn)行優(yōu)化和修飾，設(shè)計(jì)出兩組GeXP引物：一對(duì)加有cy5熒光標(biāo)記的通用引物和9對(duì)特異性嵌合引物，并建立單重GeXP體系、初步構(gòu)建多重GeXP體

4、系、對(duì)多重體系的特異性引物Tm值及特異性引物的含量進(jìn)行優(yōu)化，并驗(yàn)證其特異性及靈敏度。結(jié)果顯示，單重GeXP體系靈敏度可達(dá)102copies/μL，靈敏度與Lamp相當(dāng)，是熒光定量PCR的1000多倍；多重GeXP體系優(yōu)化結(jié)果顯示，最優(yōu)Tm值為58.5℃，最佳特異性引物含量為上下游各0.5μL，在該反應(yīng)條件下體系對(duì)于目的片段的擴(kuò)增更加的清晰、特異、更易于的判斷，同時(shí)提高了該體系擴(kuò)增的穩(wěn)定性。對(duì)其他12種常見(jiàn)畜病病原體的進(jìn)行特異性驗(yàn)證時(shí)，均