9種豬病病原體GeXP多重PCR檢測方法的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒二型、豬瘟病毒、豬藍耳病毒、水皰性口炎病毒、豬水泡病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌以及豬胸膜肺炎放線桿菌等都是臨床上較為常見的，傳染性強、流行廣泛，且危害極為嚴重的豬病病原體，極大的影響并制約著我國的生豬養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，也對社會公共衛(wèi)生安全造成了巨大的隱患。這9種疫病常以混合感染的形式出現(xiàn)，臨床癥狀十分復雜，目前的檢測手段難以應(yīng)對。GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統(tǒng)是一種新型的多基因表達定量分析

2、平臺，將GeXP的多重PCR擴增技術(shù)與毛細管電泳分析技術(shù)相結(jié)合，利用帶有熒光標記的通用引物和特異性嵌合引物的聯(lián)合擴增，使目的基因得到高效表達，該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、高通量及檢測速度快等優(yōu)點。
　　本研究根據(jù)NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列，對保守區(qū)基因序列進行分析比對，并設(shè)計9對特異性引物，利用常規(guī) PCR的單引物單模板和單引物混合模板的雙重

3、驗證方式，對以上引物進行特異性驗證分析；同時利用高效的pMD19-T Simple克隆載體構(gòu)建9種陽性克隆質(zhì)粒，應(yīng)用GeXP技術(shù)進行測序分析。結(jié)果顯示，所設(shè)計的引物均具有良好的特異性和敏感性，陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果均與 GenBank所中公布靶基因序列相符，同源性達到99.5％以上。將9對特異性引物其進行優(yōu)化和修飾，設(shè)計出兩組GeXP引物：一對加有cy5熒光標記的通用引物和9對特異性嵌合引物，并建立單重GeXP體系、初步構(gòu)建多重GeXP體

4、系、對多重體系的特異性引物Tm值及特異性引物的含量進行優(yōu)化，并驗證其特異性及靈敏度。結(jié)果顯示，單重GeXP體系靈敏度可達102copies/μL，靈敏度與Lamp相當，是熒光定量PCR的1000多倍；多重GeXP體系優(yōu)化結(jié)果顯示，最優(yōu)Tm值為58.5℃，最佳特異性引物含量為上下游各0.5μL，在該反應(yīng)條件下體系對于目的片段的擴增更加的清晰、特異、更易于的判斷，同時提高了該體系擴增的穩(wěn)定性。對其他12種常見畜病病原體的進行特異性驗證時，均