活動(dòng)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡自噬現(xiàn)象的初步研究.pdf

1、背景： 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫性疾病的原型，以B細(xì)胞過度激活、T細(xì)胞功能缺陷和大量的自身抗體產(chǎn)生為特征，可累及全身多個(gè)系統(tǒng)。雖然研究表明SLE與遺傳因素有關(guān)，但家族性SLE發(fā)病并不多見。除遺傳易感性外，SLE發(fā)病還與性激素、感染和環(huán)境等因素有關(guān)。多因素作用引起的機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂在SLE發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用，Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡便是一例

2、。其中，各種細(xì)胞因子，特別是Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)，在SLE發(fā)病機(jī)理和效應(yīng)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。研究提示，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的基因表達(dá)譜與在體研究時(shí)Ⅰ型IFN刺激產(chǎn)生的基因譜相一致，盡管并非所有的SLE患者有這樣的“干擾素標(biāo)記(IFN signature)”。IFN過度表達(dá)可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子生成，單核細(xì)胞成熟為樹突狀細(xì)胞

3、，自身B、T細(xì)胞激活，自身抗體產(chǎn)生以及自身免疫耐受缺失。也有研究證明Ⅰ型IFN受體缺陷對(duì)狼瘡小鼠的發(fā)病是一種保護(hù)因素。Toll樣受體(Toll—like receptors，TLRs)屬于Ⅰ型跨膜蛋白(typeⅠ transmembrane protein)，在特定條件下，TLRs表達(dá)異常可導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂，引發(fā)各種疾病，包括自身免疫性疾病。近年的研究發(fā)現(xiàn)TLRs在SLE發(fā)病機(jī)制其中也擔(dān)任重要角色。 Autophagy(自體吞

4、噬/自噬)源自希臘詞根：auto(自我/自己)和phagy(“吃/食”)，又稱“自食”，它是通過溶酶體降解通路促進(jìn)細(xì)胞大分子和細(xì)胞器循環(huán)的細(xì)胞降解途徑。自噬是細(xì)胞生存、分化、生長和穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，與人類多種疾病相關(guān)。研究提示自噬在免疫機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如參與MHCⅡ類抗原提呈，隨之，經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)激活和調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞。有趣的是，哺乳動(dòng)物干擾素誘導(dǎo)的eIF2α激酶PKR(RNA激

5、活的蛋白激酶)在引發(fā)自噬中發(fā)揮重要作用。此外，最近研究表明自噬是Th1/Th2細(xì)胞極化的效應(yīng)機(jī)制，在病毒識(shí)別和漿樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)分泌IFN—α中起關(guān)鍵作用。TLRs在調(diào)控自噬中的關(guān)鍵作用也得到了研究證實(shí)。 目的： 觀察活動(dòng)性SLE患者新分離的(t0)外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)是否存在自噬現(xiàn)象，同時(shí)在基因和蛋白水平測(cè)定活動(dòng)性SLE患者外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs

6、)自噬標(biāo)志物Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule—associated protein1 light chain3，MAP1LC3，以下簡(jiǎn)稱LC3)的表達(dá)水平及PBMCs中TLR7 mRNA的表達(dá)水平和血清IFN—α水平，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其內(nèi)在聯(lián)系，探討自噬在狼瘡發(fā)病中的作用機(jī)制。 方法： 1.分別以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA，n＝20)和健康志愿者(n＝10)作為

7、對(duì)照組，活動(dòng)性SLE(n=30)為病例組，應(yīng)用Ficoll—Hypaque提取各組PBMCs，通過貼壁法除去單核細(xì)胞，可獲得PBLs。然后，將新分離的(t0)PBMCs/PBLs一部分凍存于—80℃，一部分繼續(xù)培養(yǎng)24h(t24)。 2.利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM，簡(jiǎn)稱透射電鏡)觀察各組PBLs(t0)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 3.應(yīng)用Trizol Reagent

8、提取活動(dòng)性SLE組及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，利用半定量和實(shí)時(shí)定量RT—PCR方法檢測(cè)Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平；實(shí)時(shí)定量RT—PCR方法檢測(cè)PBMCs中TLR7mRNA表達(dá)水平。 4.使用細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer)按照操作說明提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western blot方法測(cè)定t0和t24時(shí)活動(dòng)性SLE組及對(duì)照組PBLs中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平。 5.利用ELISA法測(cè)定活動(dòng)性

9、SLE患者(n=20)及RA(n=20)和健康對(duì)照組(n=10)的血清IFN—α水平，并將其與臨床指標(biāo)CRP、ESR、SLEDA1及實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。 結(jié)果： 1.電鏡示：t0時(shí)，SLE組PBLs中可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡積聚，即典型的自噬現(xiàn)象；同時(shí)，在RA、健康對(duì)照組中也可見自噬現(xiàn)象，但不明顯、不典型。同時(shí)我們也觀察到SLE PBLs中發(fā)生了凋亡現(xiàn)象。 2.半定量RT—PCR結(jié)果：t0時(shí)，SLE組LC

10、3基因表達(dá)較RA組和健康對(duì)照組增強(qiáng)(p<0.05)，但各組間Beclin1基因表達(dá)無顯著差異。 3.實(shí)時(shí)定量RT—PCR結(jié)果：t0和t24時(shí)，SLE組Beclin1基因表達(dá)水平分別較RA組和健康對(duì)照組顯著增強(qiáng)(t0：1.46±0.64 vs0.60±0.23 vs0.97±0.19；t24：2.27±0.81 vs0.90±0.30 vs1.24±0.38，p<0.05)，此外，t0時(shí)RA組Beclin1 mRNA表達(dá)較健康對(duì)照

11、組顯著下調(diào)(p<0.05)；t0和t24時(shí)，SLE組LC3基因表達(dá)水平分別較RA組和健康對(duì)照組顯著增強(qiáng)(t0：4.16±2.52 vs1.13±0.38 vs1.19±0.32；t24：5.78±2.03 vs1.63±0.66 vs1.67±0.50，p<0.05)；SLE組新分離PBMCs TLR7基因表達(dá)均較RA組和健康對(duì)照組增強(qiáng)(1.51±0.793 vs0.74±0.467 vs0.78±0.263，p<0.05)，RA組與健

12、康對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 4.Western blot結(jié)果顯示：t24時(shí)，SLE組Beclin1、LC3蛋白表達(dá)較兩對(duì)照組增強(qiáng)(p<0.05)，對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；但未發(fā)現(xiàn)t0時(shí)各組間表達(dá)有顯著差別。 5.活動(dòng)性紅斑狼瘡患者血清IFN—α濃度較RA組和健康對(duì)照組顯著升高(23.55±21.9 pg/ml vs7.80±11.34 pg/ml vs7.25±8.8pg/ml，p<0.05)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析結(jié)

13、果表明：SLE血清IFN—α水平與實(shí)時(shí)定量RT—PCR所測(cè)定的t0時(shí)LC3mRNA(t=0.719，p=0.001)和TLR7 mRNA(r=0.603，p=0.005)表達(dá)水平顯著正相關(guān)，與Beclin1、SLEDAI、CRP、ESR無相關(guān)性。 結(jié)論： 活動(dòng)性SLE患者PBLs中存在自噬現(xiàn)象，自噬相關(guān)標(biāo)志物Beclin1、LC3在基因和蛋白表達(dá)水平上均上調(diào)，提示活動(dòng)性SLE患者自噬活性增強(qiáng)，活動(dòng)性SLE患者PBMCs中