天泰Ⅱ號(hào)方抗大鼠阿爾茨海默病作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 先用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物篩選，將定位航行時(shí)間超過(guò)平均值30％的大鼠剔除，剩余大鼠供實(shí)驗(yàn)用。 大鼠AD疾病模型制備。按1.5ml/kg體重腹腔注射3％的戊巴比妥鈉水溶液麻醉大鼠，將麻醉大鼠俯臥位固定在腦立體定位儀上，常規(guī)打開(kāi)鼠頭頂部的皮膚，以前囟后3.6mm中線旁開(kāi)2.5mm為顱骨標(biāo)志點(diǎn)，用牙科鉆在左右兩個(gè)標(biāo)志點(diǎn)各鉆一孔，將“老化”的1μl5mM Aβ25-35用微量注射器在5分鐘內(nèi)注入顱骨骨膜

2、下3.0mm海馬組織并留針10分鐘，術(shù)后常規(guī)處理。第26天開(kāi)始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)實(shí)驗(yàn)5天，將行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。除正常對(duì)照組動(dòng)物頸背部皮下注射0.9％生理鹽水0.6ml/kg體重外，AD模型組、假手術(shù)組大鼠均皮下注射25％D—半乳糖150mg/kg體重。末次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死大鼠，取左半腦用4％多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察腦組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的形態(tài)和海馬CA2、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，根據(jù)行為學(xué)和組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、評(píng)價(jià)AD模型的成功與否。 在制備大鼠AD疾病模型成功的基礎(chǔ)上，按以上方法制備大鼠AD疾病模型。將大鼠隨機(jī)分為7組，即天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量3個(gè)組，單味藥(No1藥)組，AD模型組與正常對(duì)照組和假手術(shù)組，每組10只大鼠(SD大鼠、SPF級(jí)、雄性、240-270g，均飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，常規(guī)給食物和水)，天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量組大鼠分別灌胃給予10％、5％、2.5％的天泰Ⅱ號(hào)方10ml/kg，單味藥(導(dǎo)師命名為No1藥，下同)組灌

4、胃給予0.5％的No1藥10ml/kg，假手術(shù)組和正常對(duì)照組則以相同的方式給予同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)用藥30天。 從給藥(天泰Ⅱ號(hào)方)第26天開(kāi)始進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括學(xué)習(xí)訓(xùn)練、定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)三部分。末次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死大鼠，取全腦。其右腦保存于液氮中，左腦用4％多聚甲醛固定。左腦進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察腦組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的形態(tài)和海馬CA2、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量；用免疫組織化學(xué)方法(SP法)研究大鼠

5、前腦抗ChAT抗體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化；用TUNEL法研究腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，凋亡指數(shù)。 用真核細(xì)胞裂解液裂解右腦組織20min抽提腦組織總蛋白，在4℃以12000rpm離心10分鐘，獲取的上清即為含目的蛋白的混合物。使用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光顯示CHOP蛋白，用凝膠圖像分析儀檢測(cè)。 另外，從假手術(shù)組、AD模型組、天泰Ⅱ號(hào)方大劑量組和單味藥(No1藥)組中每組隨機(jī)取腦組織3個(gè)，用uniz

6、ol抽提腦組織總RNA，經(jīng)檢測(cè)每個(gè)樣本RNA的OD260/OD280值均大于等于1.86，RNA電泳5S、18S、28S條帶清晰，經(jīng)電泳和濃度檢測(cè)符合實(shí)驗(yàn)要求。按照Illumina的RNA擴(kuò)增試劑盒的方法以RNA為模板合成cDNA，以純化的cDNA為模板合成cRNA，經(jīng)過(guò)Cy3熒光標(biāo)記后與RatRef-12芯片雜交，用BeadSation進(jìn)行掃描并用軟件分析大鼠腦組織表達(dá)譜基因是否存在差異。 二、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 首先制備

7、載藥腦脊液。將家兔(清潔級(jí)、2.4-2.7kg、雌雄各半)隨機(jī)分為3組，即正常組、天泰Ⅱ號(hào)方組、單味藥組，每組6只，常規(guī)飼養(yǎng)。天泰Ⅱ號(hào)方組灌胃給予家兔20％天泰Ⅱ號(hào)方10ml/kg，單味藥組灌胃給予1％No1藥10ml/kg。每天2次，共7天。末次給藥1小時(shí)后頸部放血處死家兔，用穿刺針刺入小腦延髓池抽取腦脊液800-1000μl。將同組各家兔腦脊液混合后4℃12000rpm離心10分鐘，取上清經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，即得載藥C

8、SF，-70℃保存?zhèn)溆谩?胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化。用神經(jīng)球懸浮法(培養(yǎng)液為DMEM/F12、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell，NSC)，將單克隆傳代至第三代后用含胎牛血清(Fetal boyin serum，F(xiàn)BS)的NSC轉(zhuǎn)化液處理NSC，后者分化為形態(tài)各異的多種細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)(SP法)和免疫細(xì)胞熒光行抗 NSE、抗Nestin、抗GFAP、抗GC

9、、抗ox42鑒定。經(jīng)鑒定培養(yǎng)的是NSC后，NSC培養(yǎng)液中加入載藥CSF，觀察NSC的生長(zhǎng)情況；NSC轉(zhuǎn)化液中加入載藥(天泰Ⅱ號(hào)方)腦脊液后觀察NSC的轉(zhuǎn)化情況。使用雞胚腿骨骼肌提取液、載藥CSF、自然轉(zhuǎn)化液觀察NSC向膽堿能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化率。 胎鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)和載藥(天泰Ⅱ號(hào)方)腦脊液對(duì)AD細(xì)胞模型的影響。以Neurobasal A、2％B-27、谷氨酰胺和2-Me混合液為神經(jīng)元的培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)，經(jīng)7-8d培養(yǎng)出大量

10、的細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)法行抗NSE鑒定，鑒定為神經(jīng)元后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 神經(jīng)元原代培養(yǎng)7天左右待神經(jīng)元長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)向培養(yǎng)液中加入終濃度為10μM的“老化”的Aβ25-35孵育24小時(shí)，用MTT法分析細(xì)胞生長(zhǎng)能力；行吖啶橙—溴化乙錠染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，評(píng)價(jià)AD細(xì)胞模型。對(duì)成功的AD細(xì)胞模型用載藥腦脊液進(jìn)行干預(yù)，用MTT法分析細(xì)胞生長(zhǎng)能力；并行吖啶橙—溴化乙錠染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞情況，計(jì)細(xì)胞凋亡數(shù)，計(jì)

11、算凋亡指數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。 結(jié)果：(一)、經(jīng)過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和腦組織HE染色觀察、比較海馬CA2、CA3的神經(jīng)元數(shù)量，認(rèn)為海馬雙側(cè)注射Aβ25-35合用D—半乳糖制造的AD模型是成功的；(二)、通過(guò)Morris水迷宮測(cè)試，與AD模型組相比，天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量組和單味藥組大鼠在學(xué)習(xí)訓(xùn)練、定位航行、空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)到達(dá)安全平臺(tái)的時(shí)間和距離均縮短，在空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠穿越安全平臺(tái)次數(shù)增加，提示天泰Ⅱ號(hào)方能明顯改善AD大鼠

12、的學(xué)習(xí)記憶能力。雖然天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量組比較沒(méi)有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從數(shù)值上看大劑量略有優(yōu)勢(shì)；(三)取左半腦組織的石蠟塊作3μm厚切片，經(jīng)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，AD模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、層次減少，可見(jiàn)核固縮現(xiàn)象；CA2、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯少于天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量組和單味藥組。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后行抗ChAT免疫組化染色(SP法)研究，在端腦區(qū)可見(jiàn)AD組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于天泰Ⅱ號(hào)方大、中、小劑量組(P＜0.05)；(

13、四)在左半腦組織TUNEL法實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AD組細(xì)胞凋亡明顯，天泰Ⅱ號(hào)方大劑量組中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著少于其他組，凋亡指數(shù)較低；(五)從右腦組織抽提的總蛋白，使用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光顯示CHOP蛋白，用凝膠圖像分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CHOP蛋白表達(dá)少于其他組，存在明顯差異(P＜0.05)；(六)用BeadSation進(jìn)行雜交芯片掃描并通過(guò)專業(yè)軟件分析，不同組之間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)：AD模型組對(duì)假手術(shù)組比較有39個(gè)基因存

14、在差異表達(dá)；AD模型組對(duì)天泰2號(hào)方大劑量組比較有107個(gè)基因存在差異表達(dá)；AD模型組對(duì)單味藥組比較有56個(gè)基因存在差異表達(dá)；天泰2號(hào)方型組對(duì)假手術(shù)組比較有38個(gè)基因存在差異表達(dá)；單味藥型組對(duì)假手術(shù)組比較有102個(gè)基因存在差異表達(dá)；天泰2號(hào)方型對(duì)單味藥組比較有204個(gè)基因存在差異表達(dá)。(七)“神經(jīng)球”和分化出的形態(tài)各異的多種細(xì)胞，經(jīng)鑒定為NSC、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等，我們認(rèn)為用“神經(jīng)球”懸浮法培養(yǎng)NSC成功；(八)向NSC

15、培養(yǎng)液中加入載藥CSF后NSC的生長(zhǎng)加快；NSC的自然分化液中加入載藥(天泰Ⅱ號(hào)方)腦脊液使NSC的轉(zhuǎn)化率提高。雞胚腿骨骼肌提取液可提高NSC向膽堿能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化率。加入載藥(天泰Ⅱ號(hào)方)腦脊液使NSC向膽堿能神經(jīng)元的定向轉(zhuǎn)化率增高。(九)取自海馬的細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)，7-8d后可以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞經(jīng)抗NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為神經(jīng)元。待神經(jīng)元長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)向培養(yǎng)液中加入終濃度為10μM的“老化”的Aβ25-35孵育24小時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)