隱丹參酮對阿爾茨海默病的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分隱丹參酮對淀粉樣前體蛋白代謝的作用研究 β淀粉樣蛋白(β—amyloid，Aβ)在細(xì)胞外沉積形成老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要神經(jīng)病理學(xué)特征之一。Aβ被認(rèn)為在神經(jīng)變性及其相關(guān)的認(rèn)知和行為異常中起著關(guān)鍵作用。大量的證據(jù)顯示Aβ纖維發(fā)揮了多種神經(jīng)毒性作用。因此，通過治療干預(yù)Aβ生成與代謝，可減輕或抑制Aβ造成的損害。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(β—amyloid precursor

2、protein，APP)經(jīng)過β—分泌酶(β—APP cleaving enzyme，BACE)和γ—分泌酶水解剪切形成。α—分泌酶在Aβ分子內(nèi)水解APP釋放分泌型APP片斷(secretory amyloid precursor protein—α，sAPPα)，可阻止Aβ的產(chǎn)生。中醫(yī)藥的現(xiàn)代研究表明很多中藥對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，隱丹參酮作為中藥丹參的重要成份，有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡及抗血小板聚集等作用。能透過血

3、腦屏障，改善有認(rèn)知障礙小鼠的記憶。AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知障礙，提示隱丹參酮可能對AD的防治有利。 本實(shí)驗(yàn)利用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠，觀察隱丹參酮對小鼠行為學(xué)及Aβ斑塊的影響。為了進(jìn)一步研究隱丹參酮對AD的作用，在體外培養(yǎng)原代大鼠皮層神經(jīng)元上，探討隱丹參酮對APP代謝及對Aβ生成的影響，旨在為AD發(fā)病機(jī)制的探索和新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。 目的： 1.在體用A

4、PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠，觀察隱丹參酮對小鼠行為學(xué)及Aβ斑塊的影響。 2.在過表達(dá)突變型APP大鼠皮層神經(jīng)元上觀察隱丹參酮對APP代謝的作用，探討其防治AD的機(jī)理。 方法： 選用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠，將其隨機(jī)分為5組，另取同窩陰性小鼠作為正常對照組，每組動物10只，三個月齡后開始給藥。(1)對照組(Control)：同窩陰性小鼠，每天灌胃給予等量的0.5％羧甲基纖維素鈉；(2)模型組(Tg)：轉(zhuǎn)基因

5、小鼠，每天灌胃給予等量的0.5％羧甲基纖維素鈉；(3)隱丹參酮低劑量組(CTS—L)：轉(zhuǎn)基因小鼠，每天灌胃給予5 mg/kg劑量的隱丹參酮；(4)隱丹參酮中劑量組(CTS—M)：轉(zhuǎn)基因小鼠，每天灌胃給予15 mg/kg的隱丹參酮；(5)隱丹參酮高劑量組(CTS—H)：轉(zhuǎn)基因小鼠，每天灌胃給予45 mg/kg的隱丹參酮；(6)哈伯因組(HupA)：轉(zhuǎn)基因小鼠，每天灌胃給予0.04 mg/kg的哈伯因。每周測體重，按體重調(diào)整用藥劑量，給藥4

6、個月后，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行腦組織Aβ沉積的檢測。體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元并瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)突變型APP，隱丹參酮(2.5、5、10μM)處理后，應(yīng)用MTT法檢測隱丹參酮對細(xì)胞活力的影響；應(yīng)用ELISA試劑盒分別測定細(xì)胞內(nèi)外Aβ40，Aβ42水平；Western blot法檢測CTFα、sAPPα、ADAM10、BACE及Akt的蛋白表達(dá)變化；熒光法測α、β、γ—分泌酶的活性；RT—PCR法檢測

7、ADAM10和BACE轉(zhuǎn)錄的變化。 結(jié)果： 1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠逃避潛伏期較正常組明顯延長，原象限停留時間明顯縮短。隱丹參酮組小鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短，原象限停留時間明顯延長。 2.免疫組化結(jié)果顯示，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦組織Aβ斑塊沉積較正常組明顯增加，隱丹參酮可劑量依賴性的減少腦組織Aβ斑塊的沉積。 3.隱丹參酮可劑量依賴性的減少細(xì)胞內(nèi)外Aβ4

8、0、Aβ42的水平，并明顯上調(diào)CTFα、sAPPα的蛋白表達(dá)。 4.隱丹參酮能劑量依賴性增加α-分泌酶活性，對β-分泌酶和γ-分泌酶活性沒有影響；隱丹參酮能能劑量依賴性上調(diào)ADAM10蛋白表達(dá)，但對BACE的mRNA水平及蛋白表達(dá)表達(dá)均無明顯影響。 5.用LY294002和PD98059分別阻斷相應(yīng)的PI3K信號通路及ERK通路，LY294002能夠明顯減弱隱丹參酮的作用，而PD98059無此作用；隱丹參酮可劑量、時間依

9、賴性地上調(diào)磷酸化Akt蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： 1.APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠七個月后發(fā)展有明顯學(xué)習(xí)記憶功能障礙，伴有腦組織Aβ大量沉積，隱丹參酮對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用，并且可劑量依賴性的顯著降低腦組織Aβ斑塊沉積。 2.隱丹參酮通過上調(diào)ADAM10蛋白的表達(dá)、增強(qiáng)α-分泌酶的活性，促進(jìn)APP的非淀粉樣代謝，可能是隱丹參酮防治AD作用的重要機(jī)理之一。 3.PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路參

10、與了隱丹參酮調(diào)節(jié)α-分泌酶的作用。 第二部分隱丹參酮抑制Aβ的聚集及對Aβ所致SH—SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 Aβ，老年斑的主要成分，在AD的發(fā)病和進(jìn)程中起重要作用。體內(nèi)外研究均顯示由可溶性Aβ聚集形成的Aβ纖維有神經(jīng)毒性。AD病人腦中的Aβ斑塊主要引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并且Aβ能直接誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮對谷氨酸所致新生大鼠腦皮層神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。此外，隱丹參酮對氨及東莨宕堿等多種因素導(dǎo)

11、致的記憶損傷均有改善作用，但其參與AD發(fā)病的作用及機(jī)制仍不清楚。我們在體外觀察隱丹參酮對Aβ聚集的作用；并用Aβ42誘導(dǎo)SH—SY5Y細(xì)胞損傷模型，研究隱丹參酮的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。 目的： 1.體外觀察隱丹參酮對Aβ聚集的作用。 2.觀察隱丹參酮對Aβ誘導(dǎo)的SH—SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用機(jī)理。 方法： Aβ42與隱丹參酮(0、1、2.5、5μM)置于37℃共

12、同孵育72h，應(yīng)用硫磺素T結(jié)合實(shí)驗(yàn)和電子顯微鏡觀察Aβ42的聚集狀態(tài)；培養(yǎng)SH—SY5Y細(xì)胞，隱丹參酮(0、1、2.5、5μM)與Aβ42共同作用于細(xì)胞24h，應(yīng)用MTT和LDH檢測細(xì)胞存活；用Hoechst染色及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測DHE氧化產(chǎn)物的熒光以測定O2-產(chǎn)生。 結(jié)果： 1.采用硫磺素T結(jié)合實(shí)驗(yàn)及電子顯微鏡評價隱丹參酮對Aβ42聚集的抑制作用，結(jié)果顯示隱丹參酮有明顯的抗

13、Aβ42聚集作用。 2.Aβ42對SH—SY5Y細(xì)胞的毒性作用有明顯的劑量、時間依賴關(guān)系，10μM的Aβ42與SH—SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，可造成SH—SY5Y細(xì)胞損傷模型。 3.采用MTT法、LDH法、Hoechst染色以及流式細(xì)胞檢測評價隱丹參酮對Aβ42誘導(dǎo)的SH—SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用，結(jié)果顯示，10μM的Aβ42與SH—SY5Y細(xì)胞共孵育24 h可誘導(dǎo)SH—SY5Y細(xì)胞凋亡，隱丹參酮有明顯的抗細(xì)胞凋亡作

14、用。 4.10μM的Aβ42作用于SH—SY5Y細(xì)胞24 h后，倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞內(nèi)DHE熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，隱丹參酮與10μM Aβ42共同作用于細(xì)胞呈劑量依賴性減少Aβ42引起的SH—SY5Y細(xì)胞O2-產(chǎn)生。 結(jié)論： 1.隱丹參酮呈劑量依賴性抑制Aβ42聚集。 2.隱丹參酮劑量依賴性抑制Aβ42誘導(dǎo)的SH—SY5Y細(xì)胞凋亡，隱丹參酮的細(xì)胞保護(hù)作用至少部分是通過對02-等自由基的清除作