海風(fēng)藤對(duì)阿爾茨海默病的治療作用及其作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：為了觀察海風(fēng)藤是否對(duì)癡呆模型大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，首先建立了側(cè)腦室注射Aβ大鼠癡呆模型，在海風(fēng)藤水提物灌胃后，觀察癡呆模型大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變，大鼠腦神經(jīng)元內(nèi)Aβ、炎癥因子TNF-α和IL-6以及突觸素的表達(dá)，腦內(nèi)NO、NOS的含量。然后，我們用生藥學(xué)的方法，將海風(fēng)藤進(jìn)行分離，再將各分離組分作用于SK-N-SH細(xì)胞。通過觀察各分離組分作用后，SK-N-SH細(xì)胞中APP和Aβ的表達(dá)，來確定海風(fēng)藤中抑制APP和Aβ表達(dá)的有效活性

2、成分。 方法與結(jié)果： 1.癡呆大鼠模型的建立及海風(fēng)藤水提物對(duì)癡呆模型大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的影響。 2.海風(fēng)藤水提物對(duì)癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元淀粉樣蛋白(A β)、突觸素和膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光染色結(jié)合圖像分析方法觀察側(cè)腦室注射癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元淀粉樣蛋白(A β)、TNF-α、IL-6的表達(dá)，NOS、NO的含量和突觸素的表達(dá)。 海馬神經(jīng)元Aβ表達(dá)結(jié)果如下：1)模型組大鼠

3、海馬神經(jīng)元Aβ熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其平均陽性率高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達(dá)升高；2)陽性對(duì)照組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元A β熒光強(qiáng)度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達(dá)；3)海風(fēng)藤水提物高、低劑量組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元A β的熒光強(qiáng)度明顯減弱，平均陽

4、性率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明海風(fēng)藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達(dá)；4)海風(fēng)藤高、低劑量組之間相比，海風(fēng)藤高劑量組海馬神經(jīng)元A β的熒光強(qiáng)度略低于低劑量組，平均陽性率也有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明海風(fēng)藤高、低劑量組之間，在降低A β的表達(dá)上，無明顯差別。 額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)結(jié)果如下：1)模型組大鼠的額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6熒光強(qiáng)度增強(qiáng)

5、，其平均陽性率高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)升高：2)陽性對(duì)照組與模型組相比，其額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6熒光強(qiáng)度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)；3)海風(fēng)藤水提物高劑量組與模型組相比，其額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL

6、-6熒光強(qiáng)度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；4)而海風(fēng)藤水提物低劑量組雖然降低了癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明海風(fēng)藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)，海風(fēng)藤高劑量組的療效優(yōu)于低劑量組。大鼠腦組織NO、NOS含量檢測(cè)結(jié)果如下：1)模型組大鼠腦組織中NO和NOS的含量增高，其含量高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達(dá)升高；2)陽性對(duì)照組與模型組相比，其腦組織中NO和NOS含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達(dá)；3)海風(fēng)藤水提物高劑量組與模型組相比，腦組織中NO和NOS含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；4)海風(fēng)藤水提物低劑量組與模型組相比，其腦組織NO和NOS的含量降低

8、，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明海風(fēng)藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達(dá)，海風(fēng)藤高劑量組的療效優(yōu)于低劑量組。 額葉、海馬突觸素表達(dá)結(jié)果如下：1)模型組大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯減弱，其平均陽性率低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素的表達(dá)降低；2)陽性對(duì)照組與模型組相比，其額葉、海馬神經(jīng)元突觸素?zé)晒鈴?qiáng)

9、度明顯增強(qiáng)，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠增加癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素的含量；3)海風(fēng)藤水提物高劑量組與模型組相比，其額葉、海馬神經(jīng)元突觸素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯增強(qiáng)，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明海風(fēng)藤水提物能夠增加癡呆模型大鼠額葉、海馬突觸素的表達(dá)；4)海風(fēng)藤水提物低劑量組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元突觸素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯增強(qiáng)，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義(P＜0.05)，5)海風(fēng)藤低劑量組與模型組相比，其額葉神經(jīng)元突觸素?zé)晒鈴?qiáng)度未見增強(qiáng)，平均陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明低劑量海風(fēng)藤水提物僅有增高癡呆模型大鼠海馬，沒有增高其額葉神經(jīng)元突觸素表達(dá)的作用。 3.海風(fēng)藤單體復(fù)合物畢撥明寧堿/二氫畢撥明寧堿對(duì)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)APP基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的抑制作用3.1 海風(fēng)藤單體的制備福建產(chǎn)海風(fēng)藤藥材用水提取后，提取液濃縮得到浸膏。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁

11、醇萃取，分別得到石油醚萃取相，乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相。乙酸乙酯萃取相用95％乙醇溶解后，加硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-丙酮梯度洗脫，收集洗脫流份。其中氯仿-丙酮(9:1)洗脫流份Fr.31用石油醚-丙酮反復(fù)結(jié)晶后，得到化合物1(HFT-1)。 HFT-1根據(jù)氫譜、碳譜的數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)對(duì)照，確定該結(jié)晶由化合物畢撥明寧堿(piperlonguminine，A)和二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine,

12、B)組成，由其氫譜積分確定在此結(jié)晶中A與B的比例為1:0.8。 3.2 海風(fēng)藤單體復(fù)合物畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿的藥理作用將SK-N-SH細(xì)胞分為正常對(duì)照組、DMSO組(1％DMSO)、海風(fēng)藤水提物組(15g/1)、海風(fēng)藤單體高劑量組(13.13 μ g/ml)、中劑量組(6.56 μ g/ml)、低劑量組(3.28 μ g/ml)。在細(xì)胞被藥物處理22小時(shí)后，進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。共進(jìn)行六次獨(dú)立的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。 使用MTT的技

13、術(shù)，檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞在各種藥物處理后的細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，SK-N-SH細(xì)胞在各種藥物處理24小時(shí)后，細(xì)胞活性未發(fā)生明顯變化。 使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞中APP mRNA的表達(dá)。電泳結(jié)束后，用APP與β-Actin熒光強(qiáng)度的比率代表APP mRNA的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤水提物組及海風(fēng)藤單體高劑量組的熒光強(qiáng)度比率比正常對(duì)照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而

14、DMSO組、海風(fēng)藤單體低、中劑量組的熒光強(qiáng)度比率與正常對(duì)照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風(fēng)藤水提物(15g/1)與海風(fēng)藤的畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿單體復(fù)合物(13.13μg/ml)可以降低APP mRNA的表達(dá)。使用蛋白免疫印跡(Western blot)的方法，檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞中APP的表達(dá)。使用APP與β-Actin熒光強(qiáng)度的比率代表APP的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤水提物組(5g/1、15g/1)與海風(fēng)藤單體中、

15、高劑量組(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)的熒光強(qiáng)度比率比正常對(duì)照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而DMSO組、海風(fēng)藤單體低劑量組(3.28 μ g/ml)的熒光強(qiáng)度比率與正常對(duì)照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風(fēng)藤水提物(5g/1、15g/1)與海風(fēng)藤的單體復(fù)合物畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)可以降低APP蛋白的表達(dá)。 采用免疫熒光染色

16、結(jié)合圖像分析的方法，檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞中Aβ的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤水提物組(15g/1)與海風(fēng)藤單體中、高劑量組(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)A β的熒光強(qiáng)度比對(duì)照組均明顯降低，平均陽性率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而DMSO組、海風(fēng)藤單體低劑量組(3.28 μ g/ml)的平均陽性率與正常對(duì)照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風(fēng)藤水提物(15g/1)與海風(fēng)藤的單體復(fù)合物畢撥明寧堿和

17、二氫畢撥明寧堿(6.56μg/ml、13.13μg/ml)可以降低細(xì)胞內(nèi)Aβ的表達(dá)。 結(jié)論： 一向大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射A β可明顯降低大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，損害海馬神經(jīng)元，表明A β側(cè)腦室注射模型是AD較理想的動(dòng)物模型。海風(fēng)藤水提物能夠改善Aβ側(cè)腦室注射AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)受損的海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。 二海風(fēng)藤水提物能夠降低A β側(cè)腦室注射AD模型大鼠神經(jīng)元內(nèi)A β的表達(dá)，減少膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6的