海風藤對阿爾茨海默病的治療作用及其作用機理的實驗研究.pdf

1、研究目的：為了觀察海風藤是否對癡呆模型大鼠有神經(jīng)保護作用，首先建立了側(cè)腦室注射Aβ大鼠癡呆模型，在海風藤水提物灌胃后，觀察癡呆模型大鼠行為學和組織學的改變，大鼠腦神經(jīng)元內(nèi)Aβ、炎癥因子TNF-α和IL-6以及突觸素的表達，腦內(nèi)NO、NOS的含量。然后，我們用生藥學的方法，將海風藤進行分離，再將各分離組分作用于SK-N-SH細胞。通過觀察各分離組分作用后，SK-N-SH細胞中APP和Aβ的表達，來確定海風藤中抑制APP和Aβ表達的有效活性

2、成分。 方法與結果： 1.癡呆大鼠模型的建立及海風藤水提物對癡呆模型大鼠行為學和組織學的影響。 2.海風藤水提物對癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元淀粉樣蛋白(A β)、突觸素和膠質(zhì)細胞中炎癥因子表達的影響本實驗采用免疫熒光染色結合圖像分析方法觀察側(cè)腦室注射癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元淀粉樣蛋白(A β)、TNF-α、IL-6的表達，NOS、NO的含量和突觸素的表達。 海馬神經(jīng)元Aβ表達結果如下：1)模型組大鼠

3、海馬神經(jīng)元Aβ熒光強度明顯增強，其平均陽性率高于正常對照組和假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達升高；2)陽性對照組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元A β熒光強度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達；3)海風藤水提物高、低劑量組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元A β的熒光強度明顯減弱，平均陽

4、性率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明海風藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元A β的表達；4)海風藤高、低劑量組之間相比，海風藤高劑量組海馬神經(jīng)元A β的熒光強度略低于低劑量組，平均陽性率也有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。說明海風藤高、低劑量組之間，在降低A β的表達上，無明顯差別。 額葉膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-6表達結果如下：1)模型組大鼠的額葉膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-6熒光強度增強

5、，其平均陽性率高于正常對照組和假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-6的表達升高：2)陽性對照組與模型組相比，其額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-6熒光強度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-6的表達；3)海風藤水提物高劑量組與模型組相比，其額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL

6、-6熒光強度明顯減弱，平均陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；4)而海風藤水提物低劑量組雖然降低了癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-6的表達，但差異并無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明海風藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠額葉膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-6的表達，海風藤高劑量組的療效優(yōu)于低劑量組。大鼠腦組織NO、NOS含量檢測結果如下：1)模型組大鼠腦組織中NO和NOS的含量增高，其含量高于正常對照組和假手術組，差異具有統(tǒng)

7、計學意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達升高；2)陽性對照組與模型組相比，其腦組織中NO和NOS含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠降低癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達；3)海風藤水提物高劑量組與模型組相比，腦組織中NO和NOS含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；4)海風藤水提物低劑量組與模型組相比，其腦組織NO和NOS的含量降低

8、，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明海風藤水提物能夠降低癡呆模型大鼠腦組織中NO和NOS的表達，海風藤高劑量組的療效優(yōu)于低劑量組。 額葉、海馬突觸素表達結果如下：1)模型組大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素熒光強度明顯減弱，其平均陽性率低于正常對照組和假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明腦室內(nèi)注射A β可以造成癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素的表達降低；2)陽性對照組與模型組相比，其額葉、海馬神經(jīng)元突觸素熒光強

9、度明顯增強，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明抗炎藥物布洛芬能夠增加癡呆模型大鼠額葉、海馬神經(jīng)元突觸素的含量；3)海風藤水提物高劑量組與模型組相比，其額葉、海馬神經(jīng)元突觸素熒光強度明顯增強，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明海風藤水提物能夠增加癡呆模型大鼠額葉、海馬突觸素的表達；4)海風藤水提物低劑量組與模型組相比，其海馬神經(jīng)元突觸素熒光強度明顯增強，平均陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學

10、意義(P＜0.05)，5)海風藤低劑量組與模型組相比，其額葉神經(jīng)元突觸素熒光強度未見增強，平均陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明低劑量海風藤水提物僅有增高癡呆模型大鼠海馬，沒有增高其額葉神經(jīng)元突觸素表達的作用。 3.海風藤單體復合物畢撥明寧堿/二氫畢撥明寧堿對SK-N-SH細胞內(nèi)APP基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的抑制作用3.1 海風藤單體的制備福建產(chǎn)海風藤藥材用水提取后，提取液濃縮得到浸膏。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁

11、醇萃取，分別得到石油醚萃取相，乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相。乙酸乙酯萃取相用95％乙醇溶解后，加硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-丙酮梯度洗脫，收集洗脫流份。其中氯仿-丙酮(9:1)洗脫流份Fr.31用石油醚-丙酮反復結晶后，得到化合物1(HFT-1)。 HFT-1根據(jù)氫譜、碳譜的數(shù)據(jù)，并與文獻對照，確定該結晶由化合物畢撥明寧堿(piperlonguminine，A)和二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine,

12、B)組成，由其氫譜積分確定在此結晶中A與B的比例為1:0.8。 3.2 海風藤單體復合物畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿的藥理作用將SK-N-SH細胞分為正常對照組、DMSO組(1％DMSO)、海風藤水提物組(15g/1)、海風藤單體高劑量組(13.13 μ g/ml)、中劑量組(6.56 μ g/ml)、低劑量組(3.28 μ g/ml)。在細胞被藥物處理22小時后，進行各項檢測。共進行六次獨立的重復性實驗。 使用MTT的技

13、術，檢測SK-N-SH細胞在各種藥物處理后的細胞增殖活性。結果顯示，SK-N-SH細胞在各種藥物處理24小時后，細胞活性未發(fā)生明顯變化。 使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法，檢測SK-N-SH細胞中APP mRNA的表達。電泳結束后，用APP與β-Actin熒光強度的比率代表APP mRNA的表達量。結果發(fā)現(xiàn)，海風藤水提物組及海風藤單體高劑量組的熒光強度比率比正常對照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而

14、DMSO組、海風藤單體低、中劑量組的熒光強度比率與正常對照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風藤水提物(15g/1)與海風藤的畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿單體復合物(13.13μg/ml)可以降低APP mRNA的表達。使用蛋白免疫印跡(Western blot)的方法，檢測SK-N-SH細胞中APP的表達。使用APP與β-Actin熒光強度的比率代表APP的表達量。結果發(fā)現(xiàn)，海風藤水提物組(5g/1、15g/1)與海風藤單體中、

15、高劑量組(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)的熒光強度比率比正常對照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而DMSO組、海風藤單體低劑量組(3.28 μ g/ml)的熒光強度比率與正常對照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風藤水提物(5g/1、15g/1)與海風藤的單體復合物畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)可以降低APP蛋白的表達。 采用免疫熒光染色

16、結合圖像分析的方法，檢測SK-N-SH細胞中Aβ的表達。結果發(fā)現(xiàn)，海風藤水提物組(15g/1)與海風藤單體中、高劑量組(6.56 μ g/ml、13.13 μ g/ml)A β的熒光強度比對照組均明顯降低，平均陽性率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而DMSO組、海風藤單體低劑量組(3.28 μ g/ml)的平均陽性率與正常對照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。表明海風藤水提物(15g/1)與海風藤的單體復合物畢撥明寧堿和

17、二氫畢撥明寧堿(6.56μg/ml、13.13μg/ml)可以降低細胞內(nèi)Aβ的表達。 結論： 一向大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射A β可明顯降低大鼠的學習記憶能力，損害海馬神經(jīng)元，表明A β側(cè)腦室注射模型是AD較理想的動物模型。海風藤水提物能夠改善Aβ側(cè)腦室注射AD模型大鼠的學習記憶能力，對受損的海馬神經(jīng)元有保護作用。 二海風藤水提物能夠降低A β側(cè)腦室注射AD模型大鼠神經(jīng)元內(nèi)A β的表達，減少膠質(zhì)細胞內(nèi)TNF-α、IL-6的