pGPU6-GFP-survivin-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對卵巢癌HO8910PM細(xì)胞凋亡作用的探討.pdf

1、背景與目的：近年來，人們對腫瘤的研究逐步向分子領(lǐng)域延伸，以期通過基因治療達(dá)到治愈腫瘤的目的。細(xì)胞凋亡調(diào)控的紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of apoptosis proteins，lAPs）是一個(gè)研究熱點(diǎn)。Survivin基因是IAPs中的一個(gè)新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，通過直接或間接抑制caspase3和caspase7活性等途徑阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。RNA干擾（

2、RNAi）是當(dāng)前應(yīng)用在逆向遺傳學(xué)研究中高效的基因沉默技術(shù)，能高效特異地阻斷基因的表達(dá)。目前，有關(guān)siRNA沉默survivin基因?qū)β殉舶〩O8910PM細(xì)胞凋亡作用的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)意在研究Survivin-shRNA對survivin的沉默效應(yīng)在卵巢癌細(xì)胞HO8910PM中的作用，為卵巢癌基因治療奠定一定的基礎(chǔ)。 方法：研究對象為人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞株。（1）設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對survivin的siRNA真核表達(dá)質(zhì)

3、粒載體；（2）培養(yǎng)HO8910PM細(xì)胞，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)計(jì)空白對照組（Blank組）、陰性對照組（NC組，pGPU6-GFP-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、轉(zhuǎn)染試劑對照組（MOCK組）、sur-shRNA組（pGPU6-GFP-survivin-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞）；（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測survivin mRAN表達(dá)水平；（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況；（5）Western blot檢測survivin蛋白的表達(dá)量。

4、 結(jié)果：（1）重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6-GFP-survivin-shRNA經(jīng)酶切、測序鑒定，證實(shí)插入載體目的基因片段大小與插入方向正確；（2）通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果證實(shí)干擾組的HO-8910PM細(xì)胞在48h和72h survivin mRNA表達(dá)量下降了38％和57％，與blank組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），48h到72h干擾片段的沉

5、默效應(yīng)呈增強(qiáng)趨勢；（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為52.26％，在48h和72h sur-shRNA組細(xì)胞凋亡率（30.78±0.68和38.47±0.84）高于Blank組（2.15±0.78和2.74±0.55）（P<0.05）； NC組（2.87±0.81和3.67±0.29），MOCK組（3.38±0.56和3.88±0.25）和Blank組比無差異（P<0.05）；（5）PI單染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果證實(shí)sur-shR

6、NA組細(xì)胞周期發(fā)生改變，轉(zhuǎn)染后G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加，與Blank組相比出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期升高而G2/M期下降（P<0.05）。（6）Western blot結(jié)果證實(shí)了轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-survivin-shRNA的HO8910PM細(xì)胞survivin蛋白的量明顯下調(diào)。 結(jié)論：（1）針對survivin基因的pGPU6-GFP-survivin-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。（2）針對survivin