人白介素-18基因克隆及在卵巢癌HO-8910細(xì)胞中表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖活性影響研究.pdf

1、目的：白細(xì)胞介素-18(interleuldn-18 IL-18)是一種新型的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)的方法克隆人IL-18(human terleuldn-18 hIL-18)基因，構(gòu)建人IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人卵巢癌HO-8910細(xì)胞，觀察hIL-18基因能否在人卵巢癌HO-8910細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

2、初步探討hIL-18對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響，為制備卵巢癌基因工程腫瘤疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)Genbank登錄的IL-18序列用DNAstar軟件設(shè)計(jì)上下游引物，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從胎盤(pán)組織中克隆人IL-18基因，經(jīng)鑒定正確后，與pGEM-T載體連接，構(gòu)建pGEM-hIL-18質(zhì)粒。pGEM-hlL-18質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，測(cè)序分析后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，一挑取陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基，3

3、7℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。重新設(shè)計(jì)引物，在上下游引物中分別引入SalI和EcoRI酶切位為點(diǎn)，以pGEM-hlL-18為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物和pCI-neo真核表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建pCI-hIL-18重組質(zhì)粒。常規(guī)培養(yǎng)卵巢癌HO-8910細(xì)胞，將鑒定正確的pCI-hlL-18重組質(zhì)粒用Lofectamine2000介導(dǎo)法將人IL-18基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910中，轉(zhuǎn)染分三組：空白組：卵巢癌HO-8910細(xì)胞+脂質(zhì)體

4、；對(duì)照組：卵巢癌HO-8910細(xì)胞株+pCI；實(shí)驗(yàn)組：卵巢癌HO-8910細(xì)胞+pCI-hIL-18。用一定劑量的藥物篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。分別抽提三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA用上述引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18蛋白表達(dá)；用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCI-hlL-18重組質(zhì)粒的卵巢癌HO-8910細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的變化。 結(jié)果： 1.成功從人胎盤(pán)組織內(nèi)克隆出IL-18基因，大小為

5、605bp,包含有IL-18完整的ORF，經(jīng)測(cè)序分析與Genbank登錄(登錄號(hào)NM 001562)的IL-18序列完全一致。 2.成功構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pGEM-hIL-18和真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-hIL-18。 3.重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-hIL-18經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞，用RT-PCR和ELISA檢測(cè)分別在mRNA水平和蛋白水平獲得表達(dá)。空白組和對(duì)照組均未檢測(cè)到IL-18的表達(dá)。 4.轉(zhuǎn)染pCI-hIL-18