玉米大斑病菌HOG-MAPK級(jí)聯(lián)途徑中StPBS2基因的結(jié)構(gòu)分析及功能研究.pdf

1、玉米大斑病是由玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）所引起的玉米葉片病害，在流行年份，感病品種可減產(chǎn)高達(dá)50％以上。由于玉米大斑病菌變異頻繁，使用化學(xué)藥劑對(duì)玉米大斑病的防治效果并不理想。因此，尋找新的防治方法和預(yù)防措施已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，研究植物病原菌的發(fā)育與致病的分子機(jī)制、探討更有效的防治措施已成為植物病理學(xué)和植物遺傳育種領(lǐng)域最熱門的研究課題。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)克隆了玉米大斑病菌HOG-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

2、中的1個(gè)MAPKK基因(命名為StPBS2)，并利用潮霉素B抗性、RT-PCR技術(shù)篩選得到2株該基因的RNAi轉(zhuǎn)化子。本研究擬在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析StPBS2基因的結(jié)構(gòu)特征，并利用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)一步確定RNAi轉(zhuǎn)化子及StPBS2基因表達(dá)水平。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用生物信息學(xué)方法，從JGI網(wǎng)站（http://genome.j gi-psf.org/）上公布的玉米大斑病菌數(shù)據(jù)庫中，搜索并

3、確定了病菌StPBS2基因的精確位置，并系統(tǒng)分析了其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守域;系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該基因與灰霉病菌（Botrytis cinerea）的基因BC-PBS2有較高的同源性，屬于HOG-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的MAPKK基因。
　　2.利用Real-time PCR技術(shù)分析表明，得到的2株RNAi轉(zhuǎn)化子(R3、R14)均為StPBS2基因沉默轉(zhuǎn)化子，其表達(dá)水平分別為野生型菌株該基因表達(dá)水平的62％、38％。<

4、br>　　3.對(duì)StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子的菌落及菌絲發(fā)育狀況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比，轉(zhuǎn)化子菌落生長速率明顯降低、產(chǎn)孢量降低、菌絲細(xì)胞膨大變粗，并該變化趨勢(shì)與基因的沉默水平呈正相關(guān)，說明StPBS2參與調(diào)控病菌的菌絲發(fā)育及分生孢子形成。
　　4.對(duì)StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)隨基因沉默程度增強(qiáng)，細(xì)胞壁逐漸變厚;進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞壁合成干擾物質(zhì)的敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨基因沉默效率的增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子對(duì)細(xì)胞壁合

5、成干擾物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)，說明StPBS2參與調(diào)控病菌細(xì)胞壁的發(fā)育。
　　5.對(duì)StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高滲脅迫分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)發(fā)生明顯變化，其生長速率明顯降低，且該變化趨勢(shì)與StPBS2的沉默效率呈正相關(guān)，表明StPBS2正調(diào)控病菌的高滲脅迫反應(yīng)。
　　6.對(duì)StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行氧脅迫反應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)化子菌落生長速率明顯降低，且該變化趨勢(shì)與StPBS2的沉默效率呈正相關(guān)

6、，表明StPBS2正調(diào)控病菌的氧脅迫反應(yīng)。
　　7.對(duì)StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行殺菌劑敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨基因沉默效率的降低，轉(zhuǎn)化子對(duì)殺菌劑的抗性明顯增強(qiáng);進(jìn)一步測(cè)定了野生型菌株與沉默效率最強(qiáng)轉(zhuǎn)化子R14的EC50，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子R14的EC50是野生型100倍。結(jié)果表明，StPbs2很可能是殺菌劑（腐霉利，異菌脲，咯菌腈）的作用位點(diǎn)。
　　8.利用HPLC分析StPBS2 RNAi轉(zhuǎn)化子與野生型菌株紅色次生代謝物的組分和性