豬腔前卵泡體外培養(yǎng)體系優(yōu)化及參與卵泡腔形成的分子篩選.pdf

1、卵泡腔形成階段是腔前卵泡發(fā)育最為關(guān)鍵的階段之一，自然狀況下絕大部分卵泡會(huì)在此階段發(fā)生閉鎖退化。優(yōu)化豬腔前卵泡體外培養(yǎng)體系，探究卵泡成腔機(jī)制，不僅可為豬胚胎工程研究與應(yīng)用提供充足的卵源，而且可為提高人類腔前卵泡體外培養(yǎng)效率提供借鑒。本研究對(duì)豬腔前卵泡體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)可能參與卵泡成腔的基因進(jìn)行了篩選，試驗(yàn)內(nèi)容如下：
　　試驗(yàn)一、豬PFs-OGCs體外培養(yǎng)方式的比較。通過對(duì)豬PFs-OGCs體外有血清貼壁培養(yǎng)與無血清懸浮培養(yǎng)

2、16.5 d后，觀察兩種培養(yǎng)方法下的OGCs形態(tài)，并比較PFs-OGCs成活率、成腔率，發(fā)現(xiàn)OGCs經(jīng)體外懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)均能夠形成腔樣結(jié)構(gòu)，但貼壁培養(yǎng)獲取OGCs的成活率、成腔率顯著高于懸浮培養(yǎng)(P<0.05)。
　　試驗(yàn)二、豬PFs-OGCs體外貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間的篩選。通過對(duì)豬PFs-OGCs體外貼壁培養(yǎng)16.5 d、18.5 d和20.5 d后，比較PFs-OGCs成活率、成腔率、卵母細(xì)胞直徑以及經(jīng)IVM后成熟率，并對(duì)體外

3、培養(yǎng)卵母細(xì)胞在皮質(zhì)顆粒分布、ROS水平以及卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上與體內(nèi)卵母細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比來評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)體外貼壁培養(yǎng)16.5 d的PFs-OGCs內(nèi)的卵母細(xì)胞直徑顯著小于18.5 d、20.5 d試驗(yàn)組（P<0.05）；16.5 d試驗(yàn)組成活率顯著高于20.5 d組（P<0.05）；而體外培養(yǎng)18.5 d組的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于16.5 d與20.5 d組（P<0.05)；各組間的成腔率無顯著差異（P＞0.05）。體外培養(yǎng)18.5

4、d的卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布、ROS水平、成熟線粒體的比例及高爾基體形態(tài)、數(shù)量與分布均與體內(nèi)來源的卵母細(xì)胞無明顯差異，但其透明帶厚度顯著小于體內(nèi)卵母細(xì)胞（P<0.05)，脂肪堆積較多、脂滴直徑較?。≒<0.05)。
　　試驗(yàn)三：參與卵泡腔形成的基因篩選。分離豬PFs-OGCs和EAFs-OGCs并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq），通過生物信息學(xué)方法篩選出差異表達(dá)基因。發(fā)現(xiàn)EAFs-OGCs上共31個(gè)基因上調(diào)，13個(gè)基因下調(diào)；通過GO分

5、析和Pathway分析，它們主要為參與核糖體信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化和吸收信號(hào)通路上的基因。此外，初步篩選出HPGDS、STMY1、DPPA5、MCT4、FTH1、MHC、γ-TG、fibronectin共8個(gè)可能與卵泡囊腔形成相關(guān)的重點(diǎn)候選基因。
　　結(jié)論：
　　1.體外貼壁培養(yǎng)18.5 d是豬PFs-OGCs最優(yōu)培養(yǎng)體系；
　　2.HPGDS、STMY1、DPPA5、MCT4、FTH1、MHC、γ-TG、fibrone