高表達的Hi-FGF2與B23相互作用影響Akt活化導致細胞凋亡.pdf

1、目的：探討高分子量的堿性成纖維細胞生長因子（hi-FGF2）在HEK293細胞中過表達后是否導致細胞凋亡，并且其作用機制是否與B23相互作用后影響細胞中Akt的活化有關。
　　方法：
　　1.構建pDsRed1-N1真核表達載體：采用瓊脂糖凝膠電泳技術，及膠純化回收試劑盒進行DNA提取，質粒小提去內毒素試劑盒提純擴增。
　　2.空載體pDsRed1-N1質粒的鑒定：采用雙酶切法和瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
　　3.

2、質粒hi-FGF2-pDsRed1-N1的鑒定：采用PCR擴增DNA片段法和瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
　　4.在HEK293細胞中過表達hi-FGF2：采用瞬時轉染法，熒光倒置顯微鏡觀察hi-FGF2的轉染效率。
　　5. Western-blot法測定HEK293細胞中hi-FGF2過表達后的蛋白水平。
　　6. Western-blot法測定過表達hi-FGF2的HEK293細胞中p-Akt的蛋白水平。
　　

3、7.檢測過表達的hi-FGF2與B23的相互作用：采用免疫共沉淀法。
　　8.檢測細胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀（FCM）觀察分析凋亡情況。
　　結果：
　　1.成功構建pDsRed1-N1真核表達載體。
　　2.空載體pDsRed1-N1鑒定正確。
　　3.質粒hi-FGF2-pDsRed1-N1鑒定正確。
　　4.成功轉染hi-FGF2到HEK293細胞中，轉染

4、效率目測達到70％以上。
　　5.成功轉染后hi-FGF2蛋白表達水平在50kDa左右。
　　6.過表達hi-FGF2的HEK293細胞中p-Akt蛋白水平下降。
　　7.過表達的hi-FGF2能夠與B23相互作用。
　　8.過表達hi-FGF2后細胞凋亡明顯增加。
　　結論：
　　Hi-FGF2在HEK293細胞中過表達后導致細胞凋亡，其作用機制可能是FGF2過表達后通過與B23相互作用，下調p-A