內(nèi)支架法自體組織修補膽管缺損的體外和動物實驗研究.pdf

1、第一部分模擬內(nèi)支架環(huán)境下成纖維細胞增殖的體外實驗研究
　　 研究目的：在體外模擬內(nèi)支架自體材料膽道吻合的膽道環(huán)境,觀察作為膽道瘢痕修復重要元素的成纖維細胞的增殖情況。
　　 研究方法：利用體外培養(yǎng)的成纖維細胞,模擬體內(nèi)的膽汁環(huán)境,利用顯微鏡觀察、MTT法測量不同環(huán)境下成纖維細胞的增殖和雙標記流式細胞術(shù)分析其成纖維細胞凋亡率來研究膽管瘢痕愈合過程中膽汁的作用。實驗組膽汁環(huán)境用加入1％的膽汁建立,對照組加入等量培養(yǎng)液。

2、>　　 結(jié)果：顯微鏡觀察膽汁環(huán)境培養(yǎng)48小時后實驗組成纖維細胞的增殖多于對照組；膽汁培養(yǎng)48小時及72小時后不同濃度的成纖維細胞的OD570值較對照組升高均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；雙標記流式細胞術(shù)檢測在膽汁環(huán)境中培養(yǎng)的成纖維細胞凋亡率較對照組低,比較可見具統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：膽汁環(huán)境中可以促進成纖維細胞的增殖并向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,膽汁抑制了成纖維細胞的凋亡。
　　 可以認為內(nèi)支架膽道對端吻

3、合的術(shù)式隔絕了膽汁環(huán)境對吻合口的刺激和影響,在一定程度上降低了因膽汁刺激引起的成纖維細胞增殖和向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化導致的膽道瘢痕過度愈合,為下一步的動物實驗提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分內(nèi)支架法自體組織修補膽管缺損的動物實驗研究
　　 研究目的：通過動物實驗驗證內(nèi)支架法自體組織修補膽管缺損的可行性和安全性。
　　 研究方法：利用已有的可降解膽道支架,選取巴馬小型豬為實驗對象,隨機分為兩組,每組15頭。動物手術(shù)構(gòu)建

4、膽總管缺損的模型,實驗組采用內(nèi)支架法自體組織修補膽管缺損:將設(shè)計的可降解支架與膽管兩端捆綁連接,支架中部保留1.0cm的膽管缺損并用自體大網(wǎng)膜修補；對照組采用膽管對端吻合術(shù)。術(shù)后觀察實驗動物黃疸和膽漏情況；術(shù)后2周,1月,3月每個實驗組各處死5頭實驗動物,分別比較實驗動物自身術(shù)前和術(shù)后2周,1月,3月炎癥指標(CBC,CRP)、肝酶(ALT、AST、ALP)和血總膽紅素的變化；觀察兩實驗組大體標本、肝臟組織病理切片HE染色、吻合口病理形

5、態(tài)學改變:包括HE染色、Masson染色和α-SMA、TGF-β1、b-FGF免疫組化染色；術(shù)后1月及3月兩實驗組隨機抽取實驗動物行膽道造影；測定術(shù)后2周,1月,3月時吻合口的羥脯氨酸含量；利用相對定量RT-PCR檢測術(shù)后2周,1月,3月時吻合口α-SMA、TGF-β1.b-FGF mRNA的表達情況。
　　 結(jié)果：兩實驗組均順利完成手術(shù),術(shù)后無黃疸及膽漏發(fā)生。兩實驗組炎癥指標(CBC、CRP)的檢測中,除對照組術(shù)后2周及3月白

6、細胞計數(shù)升高具統(tǒng)計學意義(P<0.05)外,其余結(jié)果無顯著差異；肝功能及總膽紅素檢測提示除對照組術(shù)后3月ALT、AST、ALP升高較術(shù)前具統(tǒng)計學意義(P<0.05),實驗組術(shù)后3月、對照組術(shù)后1月、3月總膽紅素升高較術(shù)前具統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。
　　 實驗組術(shù)后2周及1月可及手術(shù)用可降解支架在位,吻合口局部輕度水腫充血,術(shù)后3月支架已降解消失,吻合口充血水腫已基本消退。對照組術(shù)后2周及1

7、月吻合口局部輕度水腫充血,術(shù)后3月可見近端膽管輕度擴張,吻合口略狹窄。
　　 實驗組動物術(shù)后1月及3月膽道造影提示:吻合處無造影劑滲漏,肝內(nèi)膽管顯影未見擴張,膽總管引流通暢,十二指腸顯影佳。對照組可見膽管下段通暢,十二指腸顯影良好,但部分實驗動物(術(shù)后1月組:1頭／5頭,術(shù)后3月組:1頭／5頭)肝內(nèi)外膽管有不同程度的擴張。
　　 HE染色結(jié)果見術(shù)后2周可見吻合口水腫伴較多炎癥細胞浸潤,以巨噬細胞及淋巴細胞為主,粘膜下固有

8、層膠原纖維增生,可見小血管增生,實驗組較對照組增生的膠原較少；術(shù)后1月可見吻合口水腫已消退,炎性浸潤較前有減輕,粘膜下膠原增生明顯伴有纖維化,纖維結(jié)構(gòu)紊亂,新生膽管上皮生長伴有腺體增生,實驗組較對照組粘膜下纖維化和血管增生情況輕；術(shù)后3月可見吻合口新生膽管上皮生長,粘膜下膠原增厚明顯伴有纖維化,但纖維結(jié)構(gòu)紊亂情況較1月時好轉(zhuǎn),腺體增生減少,實驗組較對照組膠原增生情況輕。術(shù)后各時間點肝臟HE染色均未見明顯淤膽情況發(fā)現(xiàn)。Masson染色見術(shù)

9、后1月膠原纖維增生伴有纖維化,排列較為紊亂,實驗組較對照組膠原增生程度輕,排列相對有序；術(shù)后3月膠原纖維增生伴有纖維化明顯,排列紊亂情況較前好轉(zhuǎn),實驗組較對照組膠原增生程度輕,排列相對有序。
　　 α-SMA免疫組化陽性評分術(shù)后1月及3月兩組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05),評分隨時間推移有增高趨勢,TGF-β1免疫組化陽性評分術(shù)后2周時兩組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05),評分隨時間推移有下降趨勢,b-FGF免疫組化陽性評分術(shù)后1

10、月時兩組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05),評分隨時間推移先上升后有下降趨勢,術(shù)后1月時評分最高。
　　 術(shù)后2周時測定羥脯氨酸的含量實驗組和對照組間比較無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),術(shù)后1月和3月時實驗組和對照組間比較具統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示術(shù)后2周時實驗組較對照組b-FGF、TGF-β1 mRNA表達增加,α-SMA mRNA表達減少；術(shù)后1月時實驗組較對照組b-FGF mRNA表達

11、增加,TGF-β1、α-SMA mRNA表達減少；術(shù)后3月時實驗組較對照組b-FGF、TGF-β1mRNA表達相似,α-SMA mRNA表達減少。
　　 結(jié)論：利用大網(wǎng)膜作自體材料的內(nèi)支架法膽道對端吻合術(shù)是一種操作簡單,安全可行的膽道重建方式。
　　 動物實驗研究顯示利用大網(wǎng)膜作自體材料的內(nèi)支架法膽道對端吻合術(shù)較直接的膽道對端吻合術(shù)在近期預防膽道瘢痕過度愈合上具有優(yōu)勢,操作簡單可行,但支架的降解周期可能需適當延長,仍需大