禽病原性大腸桿菌E516株與尿道致病性大腸桿菌U56株毒力基因相關(guān)性與體內(nèi)外表達(dá)差異的研究.pdf

1、尿道感染是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，40％-50％的婦女至少經(jīng)歷過一次尿道感染，臨床表現(xiàn)多樣(尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎等)，僅在美國，每年即有大約8百萬人罹患該病，住院患者約30萬。迄今，尿道致病性大腸桿菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)是所有尿道感染中最常見的病原體。禽大腸桿菌病是部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引

2、起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。
　　 APEC和UPEC均能引起腸道外感染，具有廣泛的致病潛能?；谶@種廣泛的致病潛能，UPEC和APEC被歸為新型致病性大腸桿菌——腸道外病原性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic Escherichia

3、coli，ExPEC)。APEC和UPEC引起腸道外感染可能與它們的毒力特性有關(guān)，如黏附素、鐵攝取系統(tǒng)、毒素、保護(hù)素和侵襲素等，這些毒力特性使它們能夠在宿主環(huán)境中生存進(jìn)而產(chǎn)生疾病。諸多研究證明，APEC和UPEC的毒力因子之間存在著一定的相似性。
　　 本研究選取代表性APEC、UPEC分離株，比較它們的種系發(fā)生分型及毒力基因的分布，并通過SPF雞對(duì)它們的致病性進(jìn)行鑒定，同時(shí)比較APEC和UPEC在雞和小鼠體內(nèi)外競爭性生長情況；

4、通過感染實(shí)驗(yàn)小鼠和雞，應(yīng)用相對(duì)定量反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定受試毒力基因在體內(nèi)的表達(dá)水平，從而揭示APEC、UPEC毒力基因在同一宿主體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律，最終為弄清APEC與UPEC是否作為對(duì)方毒力基因貯庫這一關(guān)鍵問題提供依據(jù)。相對(duì)定量PCR對(duì)APEC和UPEC毒力基因在體內(nèi)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合PCR檢測(cè)毒力基因的分布以及對(duì)SPF雞致病性試驗(yàn)的結(jié)果，說明APEC和UPEC在毒力基因方面的相關(guān)性。
　　 ⑴APEC E516株和UPEC U

5、56株毒力、毒力基因相關(guān)性的研究。選取同屬O1血清型禽致病性大腸桿菌分離株E516和人尿道致病性大腸桿菌U56株，應(yīng)用單一和多重PCR技術(shù)比較它們的種系發(fā)生分型及毒力基因的分布，并通過SPF雞對(duì)它們的致病性進(jìn)行鑒定，同時(shí)以腸出血性大腸桿菌代表菌株933和非致病性大腸桿菌代表菌株K-12 MG1655作對(duì)照；并比較APEC E516株和UPEC U56株在雞和小鼠體內(nèi)外競爭性生長情況。結(jié)果顯示，E516株和U56株種系發(fā)生型一致，在毒力基

6、因相似性高；對(duì)1日齡SPF雞致病力測(cè)定結(jié)果表明U56株能產(chǎn)生與E516株相似的病變，但是致病力略低于E516；雞和小鼠體內(nèi)競爭性試驗(yàn)結(jié)果顯示U56競爭力略低于E516，這可能與兩者仍存在不同的已知或未知的毒力因子有關(guān)。上述研究部分佐證了APEC可能是UPEC的來源或UPEC的毒力基因儲(chǔ)存庫的推論。
　　 ⑵檢測(cè)ompT和feoB相對(duì)定量PCR方法的建立及其在體內(nèi)外表達(dá)水平的解析。本研究用嵌合熒光(SYBR GreenⅠ)標(biāo)記，以

7、編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的看家基因gapA為內(nèi)參基因，建立了用于ompT和feoB基因表達(dá)水平解析的兩步法實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chainreaction,qRT-PCR)。運(yùn)用該定量PCR分別建立了內(nèi)參基因gapA和目的基因ompT與feoB的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，這些標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和線性關(guān)系均符合要求，表明所建立的定量PCR體系的

8、擴(kuò)增效率高、定量準(zhǔn)確。定量PCR對(duì)ompT和feoB基因在感染雞體內(nèi)及小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平的解析結(jié)果表明，相對(duì)于體外培養(yǎng)，APEC E516株ompT在雞體內(nèi)和小鼠體內(nèi)的表達(dá)分別上調(diào)了3.73和1.45倍，feoB在雞體內(nèi)上調(diào)了1.30倍，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，下調(diào)率為0.84；UPEC U56株ompT在雞體內(nèi)和小鼠體內(nèi)的表達(dá)分別上調(diào)了1.52和2.57倍，feoB在雞體內(nèi)和小鼠體內(nèi)的表達(dá)分別上調(diào)了2.15和1.37倍；而對(duì)照菌株EH