豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及其生物學特性的研究.pdf

1、豬瘟是一種豬的高度接觸性傳染的病毒性疾病，嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是我國豬的四大疫病之一。疫苗接種是控制豬瘟的重要手段，但采用弱毒疫苗對豬免疫后．很難區(qū)分被免疫和自然感染的豬，影響了豬瘟防治。而DNA疫苗能夠同時誘導機體產(chǎn)生體液和細胞免疫反應，因不存在活疫苗毒力反強的潛在危險，已廣泛應用于抗豬瘟病毒疫苗的研究。
　　 為了建立豬瘟血清學快速診斷的方法，開發(fā)豬瘟新型疫苗，研究E2蛋白的功能，本文構建了CSFV E2原核表達重組質(zhì)粒，

2、成功制備了鼠抗豬瘟病毒E2蛋白的多抗和單抗，建立了篩選陽性雜交瘤細胞的間接ELISA方法，同時也建立了鑒定單抗特性的方法，可望在豬瘟的預防與控制中發(fā)揮重要作用。
　　 首先，根據(jù)GenBank中登錄的CSFV基因組序列及原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1的多克隆位點，設計了一對針對E2蛋白A/D區(qū)域的原核表達引物，利用PCR技術從本實驗室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TE2中擴增出大小為290bp的基因E（A），為了獲得E（A）

3、蛋白作為制備單抗的抗原，我們應用DNA重組技術，將E（A）基因亞克隆到原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR與雙酶切鑒定后，篩選獲得陽性克隆pGEX-4T-E（A）。然后經(jīng)IPTG誘導對含有pGEX-4T-E（A）質(zhì)粒的Rosetta菌進行了大量表達，獲得了較高濃度的GST-E（A）包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性GST-E（A）融合蛋白。

4、融合蛋白的分子量約為35.0KD，與預期結(jié)果相符。Folin-酚法測定提取蛋白的濃度為2.14mg/ml，滿足下一步實驗的要求。
　　 其次，利用純化的GST-E（A）融合蛋白免疫BABL/c小鼠，制備鼠抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體。取三次免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按10：1進行融合，10～15天后初次檢測。試驗中共融合兩次，兩次融合率分別約為80％和70％，初檢陽性率分別為10％和5％。經(jīng)多次亞克隆反復篩選后，

5、共獲得兩株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為C3和A1。雜交瘤細胞經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，仍能分泌高效價的抗體。C3和A1的雜交瘤細胞上清和小鼠腹水ELISA效價分別為1：2000、1：2000和1：256000、1：128000左右。Western-blot和IFA分析表明，兩株單抗均可以識別CSFV兔化弱毒疫苗株，同時也與GST-E（A）融合蛋白發(fā)生特異性的反應，說明該單抗是針對豬瘟病毒E2蛋白上的一個保守線性表位。

6、　　 最后，為了研究CSFV E2蛋白抗原表位的性質(zhì)，對單抗C3的抗原表位進行了初步篩選，應用DNAStar分析軟件對E（A）基因的原表位進行分析，分段表達各抗原表位的融合蛋白GST-E（A1）和GST-E（A2），利用Western-blot分析，結(jié)果顯示，單抗C3識別的抗原表位位于序列TAVSPTTLRT之間，該結(jié)果需利用噬菌體展示技術進一步證實。
　　 綜上所述，本研究構建了E2原核表達的重組質(zhì)粒，成功制備了兩株針對CS