以臍帶間充質干細胞為載體依賴腺病毒的雙重靶向系統(tǒng)對肝癌的治療作用研究.pdf

1、背景和目的:肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤，在我國僅次于肺癌位列第二，其死亡率位于惡性腫瘤病死率的第三位，主要原因為大多數(shù)患者伴隨基礎的肝臟疾病，如肝硬化、肝功能代償失調，手術切除效率低，放療和化療的效果差等，所以尋求新的有效的肝癌治療藥物或方法顯得尤為重要。利用抑癌基因、腫瘤抑制基因或免疫調節(jié)基因等進行的腫瘤靶向治療是生物基因治療的重要研究內容，與傳統(tǒng)的治療方法相比，它具有腫瘤特異性，殺傷腫瘤細胞的同時基本不損傷正常組織，被認為是腫瘤

2、治療中最具前景的治療方法。但目前的難題在于:病毒基因載體的靶向性較差，尤其是對于較隱蔽的腫瘤微小轉移灶或術后復發(fā)病灶，載體很難被準確運送到這些部位?；谶@些問題，探索安全有效靶向性更好的基因轉導系統(tǒng)成為基因治療研究的重要課題。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類存在于多種組織，具有多向分化潛能的成體干細胞。MSCs具有向炎癥、腫瘤部位定向趨化，低免疫原性，易于進行基因改造等優(yōu)點，已成為基因治療的理

3、想載體。本研究基于上述理論，探索出一套有效的靶向治療系統(tǒng)，即利用E1A基因修飾的臍帶間充質干細胞(HUMSCs)復制包裝出攜帶由人端粒酶逆轉錄酶啟動子(human telomerase reverse transcriptase promoter, hTERTp)驅動的特異抑瘤基因IL24的腺病毒，通過HUMSCs向腫瘤部位歸巢的能力，在腫瘤部位釋放出攜帶此治療基因的腺病毒顆粒發(fā)揮抗腫瘤作用，本課題重點研究這套靶向治療體系單獨或聯(lián)合5-

4、FU在體內外對HepG2肝癌移植瘤模型的治療作用。
　　方法:利用組織塊貼壁法從臍帶華通氏膠組織(Wharton's Jerry，WJ)中分離培養(yǎng)HUMSCs;流式細胞術分析HUMSCs陽性及陰性的表面標志;利用成骨、成脂誘導體系鑒定HUMSCs的分化潛能。利用PCR、重疊PCR(overlap PCR)、酶切、連接等分子生物學技術構建pGL3-hTERTp報告基因載體及pLentiR.E1A、pAd-hTERTp-IL24、pA

5、d-CMV-Luc慢病毒及腺病毒表達載體，經測序驗證其基因序列的正確性。利用293T細胞包裝慢病毒顆粒，利用293A細胞包裝腺病毒顆粒，并感染HUMSCs確定各自合適的感染復數(shù)（multiplicity of infection, MOI）。將pGL3-hTERTp、pGL3-Basic及pGL3-Control三種報告基因載體分別與pRL-TK共轉染hTERT陽性的腫瘤細胞及其陰性的MRC-5和HUMSC，利用雙熒光素酶的方法鑒定hT

6、ERT啟動子的轉錄特異性。利用實時定量PCR的方法分別檢測MSC.LentiR+Ad-Track和MSC.LentiR.E1A+Ad-Track中不同時間點的病毒相對拷貝數(shù)。體外利用Transwell的方法研究雙病毒感染對HUMSCs向HepG2細胞趨化的影響;采用皮下接種的方法建立HepG2肝癌移植瘤模型，尾靜脈注射MSC.LentiR+Ad-CMV-Luc或MSC.LentiR.E1A+Ad-CMV-Luc至荷瘤小鼠體內，IVIS成

7、像系統(tǒng)觀察其向腫瘤部位的歸巢情況。體外采用CCK8細胞增殖抑制實驗、細胞凋亡實驗及Western blot檢測Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用對HepG2肝癌細胞系生長的抑制作用及誘導凋亡的能力。體內，對HepG2肝癌移植瘤模型聯(lián)合應用MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24和低劑量5-FU進行治療，每3天測量腫瘤直徑，根據腫瘤體積計算抑瘤率，評價療效;治療結束后取出腫瘤組織，固定后制作石蠟切片，利用免

8、疫組化的方法觀察腫瘤組織中MSC的分布及IL24的表達情況;TUNEL的方法檢測腫瘤組織中細胞凋亡情況。
　　結果:成功從臍帶WJ組織中分離培養(yǎng)HUMSCs，鑒定其表面MSCs陽性標志CD73、CD90、CD105均為強陽性，MSCs陰性標志如CD34、CD19、CD45均為陰性，并且可以在體外被誘導分化為脂肪細胞、骨細胞。成功構建載體pGL3-hTERTp、pLentiR.E1A、pAd-CMV-Luc及pAd-hTERTp-I

9、L24，經測序證明其基因序列正確。雙熒光素酶的方法驗證hTERT啟動子在不同的腫瘤細胞中具有較高的轉錄活性，而在正常細胞如MRC-5及HUMSCs細胞中轉錄活性極低，說明克隆的hTERT啟動子片段具有特異的轉錄活性。腺病毒Ad-Track及慢病毒LentiR.E1A共同感染HUMSCs后，隨著腺病毒早期復制基因E1A逐漸被表達，Ad-Track利用E1A在HUMSCs中啟動復制程序，產生更多的腺病毒顆粒，最終將MSC裂解并釋放具有感染能

10、力的病毒顆粒。體外，荷載病毒的HUMSCs在LentiR.E1A感染32h之內可以穿過transwell小室向培養(yǎng)HepG2細胞的下室遷移。體內建立BALB/C裸鼠HepG2肝癌移植瘤模型，尾靜脈注射MSC.LentiR.E1A+ Ad-CMV-Luc后，第1天遷移并聚集于腫瘤部位;第2天生物發(fā)光信號開始減弱直至第4天消失;而在第7天時又在腫瘤部位檢測到生物發(fā)光信號，為釋放的腺病毒顆粒感染腫瘤細胞所致。Ad-hTERTp-IL24具有特

11、異的抑瘤作用，與5-FU聯(lián)用不僅增強IL24的抗腫瘤作用，還可以通過增加腫瘤細胞攝取腺病毒的方式，達到協(xié)同的抗腫瘤作用。體內，經尾靜脈注射MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24并聯(lián)合低劑量5-FU對HepG2移植瘤的生長具有明顯抑制作用，療效優(yōu)于單獨治療。
　　結論:本課題首次建立由MSC.LentiR.E1A運載攜帶腫瘤治療基因的復制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-IL24的雙重靶向治療系統(tǒng)，與5-FU聯(lián)用可