人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝臟疾病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　 背景：地塞米松是糖皮質(zhì)激素類藥物，常被用來促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨、成脂、成軟骨分化。最近，地塞米松也應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，尤其是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，亦有研究顯示地塞米松能減少細(xì)胞的凋亡。因此，需要系統(tǒng)地研究地塞米松對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞基本細(xì)胞生物學(xué)的影響。另外，雖然很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都證明間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)某些疾病的有效性，但是間充質(zhì)干細(xì)胞的生物安全性也需要明確。所以，本實(shí)驗(yàn)也初步探討了臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)

2、胞的生物安全性。
　　 目的：由于具有獨(dú)特的器官修復(fù)功能和免疫調(diào)節(jié)功能，MSC廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療研究。但是MSC在體外不容易擴(kuò)增，常常需要添加地塞米松來促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因此，需要系統(tǒng)地研究和比較地塞米松對(duì)MSC的基本細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。另外，也需要初步探討MSC的安全性。
　　 方法：從人臍帶中獲取MSC，并對(duì)MSC做出鑒定，包括流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型和分化。然后經(jīng)過不同濃度的地塞米松培養(yǎng)2周后，收獲MSC細(xì)胞，

3、進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型、促增殖實(shí)驗(yàn)、免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)分泌因子等等。在生物安全性方面，我們檢測(cè)了MSC的TP53基因序列、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)測(cè)定、細(xì)胞核型分析、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)和致瘤性實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的地塞米松對(duì)MSC的作用有差異性。在促增殖和影響凋亡上，高低兩種濃度的地塞米松對(duì)MSC的作用剛好出現(xiàn)相反的效果。然而，不管濃度高低，地塞米松都能損壞MSC的免疫調(diào)節(jié)能力。高濃度的地塞米松還明顯抑制了MS

4、C分泌HGF。而低濃度的地塞米松則促進(jìn)了VEGF的分泌。生物細(xì)胞安全性方面的實(shí)驗(yàn)沒發(fā)現(xiàn)MSC有毒性及致瘤性。
　　 結(jié)論：低劑量的地塞米松能促進(jìn)MSC的體外擴(kuò)增，并增強(qiáng)MSC的抗凋亡能力。但是由于地塞米松能損壞MSC的免疫調(diào)節(jié)能力，因此，要利用MSC的免疫調(diào)節(jié)功能來治療疾病，則不合適在MSC的培養(yǎng)過程中添加地塞米松。低濃度的地塞米松能促進(jìn)MSC高分泌VEGF，這有利于提高M(jìn)SC治療促進(jìn)血管新生類疾病。而且，我們的數(shù)據(jù)也證明了MS

5、C使用的安全性。
　　 第二部分
　　 背景：肝纖維化(liver fibrosis，LF)是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，由肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積所致。伴隨著纖維膠原的增多，疤痕組織和增生性結(jié)節(jié)代替正常組織，此時(shí)進(jìn)展為肝硬化，導(dǎo)致正常肝功能的衰竭。各種原因引起的肝臟炎癥，或損傷后組織修復(fù)過程的代償反應(yīng)，均可導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。目前認(rèn)為纖維化階段的肝臟病變是可逆的，但若

6、沒有得到及時(shí)有效的治療，則最終往往導(dǎo)致肝腹水、上消化道出血、肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等一系列疾病，是引起人類死亡的主要原因之一。間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，能促進(jìn)器官特異性祖細(xì)胞的增殖和分化；MSC亦具有能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等潛能，參與受損組織的再生修復(fù)。由此可見，探索研究MSC治療肝纖維化及其作用機(jī)制，具有重大意義。
　　 目的：基于MSC的再生修復(fù)實(shí)質(zhì)器官和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，本項(xiàng)研究旨

7、在研究臍帶MSC抗纖維化機(jī)制，期望開發(fā)出一種新型的有效的治療肝纖維化的細(xì)胞制劑，為UC-MSC在人肝纖維化及肝硬化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：腹腔注射橄欖油稀釋的四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型，每3天注射一次，共注射30次。在體內(nèi)趨化研究實(shí)驗(yàn)中，在造模成功后，將體外CM-DiI熒光標(biāo)記的人臍帶MSC通過尾靜脈注射移植到體內(nèi)。24小時(shí)后，取肝臟做冰凍切片，免疫熒光顯微鏡檢測(cè)CM-DiI熒光強(qiáng)度，并和健康對(duì)照組比較。治

8、療組，造模結(jié)束后，每周給1次MSC細(xì)胞治療，治療3周和6周。取肝臟做HE染色和Masson染色，評(píng)價(jià)肝細(xì)胞和膠原纖維的變化。同時(shí)，我們還評(píng)價(jià)了UC-MSC在體外向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的情況。
　　 結(jié)果：UC-MSC分泌高濃度的HGF和MMPs。UC-MSC移植治療肝纖維化模型小鼠后，HE染色和Masson染色均提示，UC-MSC能明顯促進(jìn)膠原纖維的消退和肝細(xì)胞再生，使得硬化的肝臟基質(zhì)得到正常重建。此外，UC-MSC能在體外能夠分化成

9、為肝細(xì)胞，同時(shí)具有部分肝細(xì)胞和MSC的功能。
　　 結(jié)論：人UC-MSC可以有效地逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，并起到良好的抗纖維化治療作用；其作用機(jī)制可能與分泌豐富的HGF和MMPs有關(guān)。
　　 第三部分
　　 背景：急性肝功能衰竭是在原有肝病的基礎(chǔ)上，肝功能的嚴(yán)重?fù)p傷或者肝細(xì)胞的廣泛性壞死引起的。目前整個(gè)肝臟移植治療是最好的治療方法，但是整個(gè)肝移植也面臨著一系列問題，肝源不足就是一個(gè)瓶頸難題。肝細(xì)胞移植治療曾經(jīng)是一個(gè)治

10、療手段。然而肝細(xì)胞移植的技術(shù)難題依然存在，比如肝細(xì)胞在體外難于增殖擴(kuò)增，異體肝細(xì)胞引起的免疫排斥反應(yīng)等等，均限制了臨床的應(yīng)用。因?yàn)樘剿餮芯縈SC治療急性肝衰竭，其意義重大。
　　 目的：基于MSC的再生修復(fù)實(shí)質(zhì)器官和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，本項(xiàng)研究旨在研究臍帶MSC治療急性肝功能衰竭，期望開發(fā)出一種新型的有效的治療急性肝衰竭的細(xì)胞制劑，為UC-MSC在人急性肝衰竭的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：聯(lián)合應(yīng)用D-氨

11、基半乳糖和脂多糖腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性肝衰竭，觀察在造模后出現(xiàn)死亡的時(shí)間和生存率。在造模后，給與MSC移植治療，并觀察不同時(shí)間點(diǎn)和不同劑量對(duì)急性肝衰竭小鼠的生存率的影響。
　　 結(jié)果：D-氨基半乳糖和脂多糖聯(lián)合應(yīng)用能成功誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭，大概在造模后8-10小時(shí)內(nèi)，大部分小鼠開始出現(xiàn)死亡。MSC的治療能提高造模小鼠的生存率，但療效和治療時(shí)間密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：人UC-MSCs可以有效地治療急性肝衰竭小鼠，挽救了