人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢早衰的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：卵巢早衰( premature ovarian failure，POF)是指女性40歲前以閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征的一種疾病?；熓悄壳爸委煇盒阅[瘤的有效手段，但化療藥會(huì)對患者卵巢造成不同程度的損傷，甚至有部分患者發(fā)展成為POF。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX），是化療常用的烷化劑，研究CTX造成的POF治療方案具有十分重要的意義。目前治療POF的方案均不能從根本上起到修復(fù)卵巢的作用，近

2、些年間充質(zhì)干細(xì)胞治療POF成為研究熱點(diǎn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）來至廢棄的臍帶，資源豐富獲取便捷，屬于免疫缺陷細(xì)胞，具有多向分化潛能成為干細(xì)胞治療POF的重點(diǎn)研究對象。我們將hUMSCs從臍帶中分離出來，期望探究出一種可修復(fù)卵巢，從根本上解決POF的治療方案。
　　目的：
　?。?）采用組織貼壁法分離hUMSCs，對其進(jìn)行鑒定并

3、觀察其生物學(xué)特性。
　?。?）觀察hUMSCs成脂、成骨、成軟骨分化能力。
　?。?）評價(jià)CTX造POF動(dòng)物模型方案是否成功。
　　（4）探究hUMSCs對POF大鼠的治療作用。
　?。?）初步探究hUMSCs修復(fù)卵巢功能的可能機(jī)制。
　　方法：
　　采用組織貼壁法將hUMSCs從臍帶中分離出來并進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原；分別加入成脂肪、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化液誘導(dǎo)其向

4、成脂、成骨、成軟骨方向進(jìn)行分化，觀察其多向分化潛能。
　　使用環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注入SD大鼠造POF模型，第1d注入濃度為10mg/ml的CTX，第2～15d連續(xù)注射濃度為3.2mg/ml的CTX，按照5mL/kg體重的量注射，每天1次。觀察記錄大鼠一般情況。血清檢測建模前后1d卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（Estradiol，E2）含量，結(jié)合HE染色觀察建模前后卵巢組織形態(tài)以

5、及卵泡情況判斷建立的POF模型是否成功。
　　給每只治療組大鼠尾靜脈注射1×106/ml hUMSCs，采用熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測hUMSCs在卵巢內(nèi)的分布和分化情況。hUMSCs移植后1d、17d檢測血清中卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、

6、血清抑制素B（Serum inhibin B，INHB）、抗苗勒管激素（Anti Mullerian hormone，AMH）含量評價(jià)hUMSCs對卵巢儲(chǔ)備功能改善情況。綜合免疫組化檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cysteine aspartic acid protease3，Caspase-3）信號表達(dá)情況；hUMSCs移植后HE染色觀察到的卵巢組織形態(tài)學(xué)變化、卵泡數(shù)情況；透射電鏡觀察到的卵巢超微結(jié)構(gòu)變化情況；FISH檢測到h

7、UMSCs在卵巢內(nèi)的分化情況，推測hUMSCs修復(fù)POF的可能機(jī)制。讓大鼠進(jìn)行交配，孕14d解剖觀察活胎數(shù)和吸收胎數(shù)比較hUMSCs對大鼠生育能力改善情況。
　　結(jié)果：
　?。?）從臍帶中分離得到的細(xì)胞在鏡下觀察成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，大部分呈梭形。流式細(xì)胞儀檢測其高表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR，結(jié)合表面抗原和細(xì)胞形態(tài)，證明獲取的細(xì)胞為hUMSCs。
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8、2）油紅O染色后觀察細(xì)胞由長梭形變?yōu)闄E圓形或者圓形且細(xì)胞內(nèi)有被染成紅色的光亮脂滴，提示成功誘導(dǎo)分化出了脂肪細(xì)胞；茜素紅染色后觀察到細(xì)胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切吻覂?nèi)有沉積的鈣鹽，提示成功誘導(dǎo)分化出了成骨細(xì)胞；阿爾新藍(lán)染色后觀察到細(xì)胞染色呈強(qiáng)陽性，而未加入誘導(dǎo)分化液的細(xì)胞呈松散狀，細(xì)胞形態(tài)依舊呈長梭形，提示成功誘導(dǎo)分化出了成軟骨細(xì)胞。證明了hUMSCs具有多向分化潛能。
　?。?）與陰性對照組相比，模型組大鼠血清中E2含量下降，F(xiàn)SH含量

9、增高；HE染色切片觀察到模型組大鼠生長卵泡數(shù)均減少、閉鎖卵泡數(shù)增加，符合臨床上POF的典型特征，說明成功建立POF模型。
　?。?）血清檢測得到hUMSCs移植組INHB、AMH的量在hUMSCs移植后17d均比模型對照組高。HE染色觀察到hUMSCs移植組在1d、17d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長卵泡數(shù)均高于模型對照組，閉鎖卵泡數(shù)降低，證明hUMSCs可改善卵巢儲(chǔ)備功能，對卵巢有修復(fù)作用。
　?。?）FISH檢測結(jié)果顯示，hUMSCs

10、在卵巢組織間隙分布，且有少量分化成了卵巢顆粒細(xì)胞和卵子細(xì)胞。電鏡觀察到hUMSCs移植組卵巢顆粒細(xì)胞逐漸被修復(fù)。免疫組化檢測未在hUMSCs移植組生長卵泡中檢測到Caspase-3陽性信號，且Caspase-3的信號表達(dá)低于模型對照組。推測hUMSCs可能是通過修復(fù)卵巢顆粒細(xì)胞抑制生長卵泡凋亡，分化為卵子細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞來對卵巢進(jìn)行修復(fù)。
　?。?）hUMSCs移植組得到的活胎數(shù)有上升趨勢，但與模型對照組無顯著性差異。
　　

11、結(jié)論：
　?。?）組織貼壁法可成功將hUMSCs分離出來并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，hUMSCs呈長梭形，表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表面抗原，具有多向分化潛能。
　?。?）此次CTX造模方案成功建立了大鼠POF模型，hUMSCs可改善POF鼠卵巢儲(chǔ)備功能，對卵巢起修復(fù)作用。
　　（3）hUMSCs可能是通過修復(fù)卵巢顆粒細(xì)胞，抑制生長卵泡凋亡，部分分化為卵子細(xì)胞、顆粒細(xì)胞來對卵巢進(jìn)行修復(fù)。
　?。?）hUMSCs對POF大鼠生育