雙丹方成分分析及其主要成分丹參素配伍丹皮酚對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、1研究背景：
　　冠心病，又稱為缺血性心臟病，其發(fā)作率高、致殘率高、死亡率高，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。祖國醫(yī)學(xué)對(duì)于冠心病的用藥施治，具有兩千余年的豐富實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。雙丹方由丹參、牡丹皮組成，為活血化瘀的經(jīng)典古方之一，其系列制劑如雙丹顆粒、雙丹片、雙丹口服液、雙丹膠囊等長期應(yīng)用于冠心病的臨床實(shí)踐，取得了良好的療效。然而，迄今為止，相對(duì)于廣泛開展的臨床研究而言，雙丹方的基礎(chǔ)研究則相對(duì)滯后。與多數(shù)中藥復(fù)方一樣，雙丹方所含化學(xué)成分復(fù)雜，

2、有效成分至今尚不明了，治病的作用機(jī)理尚未闡明，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用及在國際上的推廣。因此，闡明雙丹方的藥效物質(zhì)成分及其治療冠心病的作用機(jī)制，不僅可以為祖國醫(yī)學(xué)復(fù)方配伍的科學(xué)合理性提供可靠的理論依據(jù)，也將為開發(fā)與國際接軌的成分清楚、靶點(diǎn)和作用機(jī)制明確的中藥新藥奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究擬通過血清藥物化學(xué)等研究手段，探尋雙丹方的主要有效成分，在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)該方有效成分的藥物動(dòng)力學(xué)研究和抗心肌缺血的藥效學(xué)研究，初步闡明該方的組方原理和作用機(jī)制。

3、
　　2方法：
　　2.1雙丹方體外成分分析：建立雙丹凍干粉的體外指紋圖譜HPLC分析方法，色譜條件為：色譜柱ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm5μm，Agilent），柱溫30°C，流動(dòng)相為甲醇與2％冰醋酸，采用梯度洗脫程序：甲醇-2%冰醋酸（5∶95，v/v）0 min，（5∶95）10 min，（25∶75）30 min，（40∶60）50 min，（60∶40）70 min，流速1 mL·min-

4、1，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長280 nm；以建立的HPLC分析方法對(duì)雙丹凍干粉進(jìn)行指紋圖譜分析表征，確認(rèn)各物質(zhì)成分歸屬。
　　2.2雙丹方體內(nèi)成分分析：采用血清藥物化學(xué)的研究方法，建立雙丹凍干粉經(jīng)口灌胃后大鼠血清的 HPLC指紋圖譜，結(jié)合體外樣品指紋圖譜，分析比較雙丹凍干粉給藥后所得血清樣品，鑒定雙丹凍干粉大鼠血中移行成分。
　　2.3丹參素配伍丹皮酚與獨(dú)用丹皮酚的大鼠血漿藥物動(dòng)力學(xué)及組織分布特性：建立大鼠含藥血漿及組織樣品

5、中丹皮酚的 HPLC分析方法，色譜條件為色譜柱 SinoChrom ODS–BP C18（250 mm×4.6 mm5μm，依利特），柱溫30°C，流動(dòng)相為甲醇-2%冰醋酸（70∶30，v/v），流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長274 nm；以建立的HPLC分析方法對(duì)丹皮酚單獨(dú)給藥及丹參素配伍丹參素給藥的大鼠血漿及組織（心、肝、脾、肺、腎和腦）勻漿進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化及其在組織中分布的特性。
　　2

6、.4丹參素配伍丹皮酚對(duì)異丙腎上腺素所致心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究：大鼠連續(xù)給予丹參素（160 mg·kg-1）、丹皮酚（80 mg·kg-1）或丹參素配伍丹皮酚21天，于第20、21天采用皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素（85 mg·kg-1）方法造成大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死模型，戊巴比妥麻醉（35 mg·kg-1）后記錄心電圖，取血和心肌組織分別檢測(cè)cTnI、CK-MB、LDH及TBARS、SOD、CAT等系列生化指標(biāo)的變化。
　　3結(jié)果：

7、
　　3.1雙丹方體外成分分析：雙丹凍干粉指紋圖譜中有11個(gè)共有特征峰，其中1、6和11號(hào)峰分別為源自牡丹皮的沒食子酸、芍藥苷和丹皮酚，2、3、4、5、7、8、9和10號(hào)峰分別為源自丹參的丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。
　　3.2雙丹方體內(nèi)成分分析：大鼠口服雙丹凍干粉后經(jīng)鑒定有8種血清移行原型成分，分別為源自牡丹皮的沒食子酸、芍藥苷和丹皮酚，源自丹參的丹參素、原兒茶酸、咖啡酸、迷迭

8、香酸和丹酚酸B，此8種成分將有可能成為雙丹方藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.3丹參素配伍丹皮酚與獨(dú)用丹皮酚的大鼠血漿藥物動(dòng)力學(xué)及組織分布特性：丹參素配伍丹皮酚給藥后血漿丹皮酚藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)及組織藥物濃度較丹皮酚單獨(dú)給藥有顯著改變，配伍給藥后血漿丹皮酚濃度顯著降低（P<0.01），藥物平均滯留時(shí)間顯著延長（P<0.001），表觀分布容積顯著增大（P<0.001），表明丹皮酚在心、腦及肺組織中的濃度顯著升高（P<0.001）。
　

9、　3.4丹參素配伍丹皮酚對(duì)異丙腎上腺素所致心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究：丹參素配伍丹皮酚對(duì)異丙腎上腺素所致的大鼠心肌損傷具有顯著的保護(hù)作用，與模型組比較，各單用組及配伍組大鼠心梗面積、血清心梗標(biāo)志物（cTnI，CK-MB，LDH)水平、心肌組織 TBARS水平、凋亡細(xì)胞數(shù)、凋亡相關(guān) Bax蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P<0.001），心肌組織抗氧化酶（SOD、CAT）活力、Ⅱ相解毒酶（GPx、GR、GST、NQO1）活力、抗凋亡相關(guān)蛋白Bc

10、l-2表達(dá)水平顯著上升（P<0.001），心電圖及心肌病理形態(tài)也得到顯著改善；配伍組對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善明顯優(yōu)于單用組（P<0.01或P<0.001）。
　　4結(jié)論：
　　本研究分別采用血清藥物化學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)手段、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷确椒?，初步明確了雙丹方的藥效物質(zhì)成分，證實(shí)了丹參素、丹皮酚配伍組合具有心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基、激活機(jī)體內(nèi)源性抗氧化通路以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。上述研究結(jié)果為雙丹方配伍作用的原