高效抗SEB中和保護(hù)性抗體的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、葡萄球菌腸毒素（Staphyloccucal enterotoxins，SEs）是由葡萄球菌分泌的細(xì)菌外毒素，目前已報(bào)道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多種血清型，共稱為葡萄球菌SE類超抗原，是細(xì)菌性食物中毒、化膿性感染、院內(nèi)感染的重要毒素。
　　 作為一類超抗原，通過(guò)橋聯(lián)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞上的MHCⅡ類分子和TCR的β鏈Ⅴ區(qū)，形成MHCⅡ類分子:SEs(∶)TCR的三元復(fù)合物，直接激活T淋巴

2、細(xì)胞，并導(dǎo)致一系列炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而引起高熱、惡心、腹瀉及毒素休克綜合征(TSS)。由金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)引起的TSS的病死率可達(dá)50％，與流感并發(fā)的SEB感染的死亡率更高達(dá)90％以上，因此SEB被美國(guó)特殊作戰(zhàn)處列為常規(guī)儲(chǔ)存的“標(biāo)準(zhǔn)”（“經(jīng)典”）生物戰(zhàn)劑。
　　 目前臨床上尚無(wú)針對(duì)SEB中毒的有效疫苗和藥物，而治療性單克隆抗體因其具有高特異性和低毒副作用的特性，常在SEB的防治過(guò)程中被列為首選方案。國(guó)內(nèi)外的多個(gè)

3、研究小組也獲得了一些鼠源抗SEB的中和性單克隆抗體，但只能達(dá)到部分的中和保護(hù)效果(63％)，其對(duì)SEB誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞激活的抑制作用也僅為50-75％;說(shuō)明單一的單克隆抗體并非是超抗原家族致病過(guò)程最理想的抑制劑。而多種中和性抗體的聯(lián)合應(yīng)用，雖可實(shí)現(xiàn)理想的協(xié)同作用，但由于其成分相對(duì)復(fù)雜、在藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面需多次進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)等因素，限制了推廣和應(yīng)用。此外，由于多數(shù)中和性抗體的結(jié)合表位不明確，抗體的中和保護(hù)機(jī)制尚不明了，使研究難以有突破性進(jìn)展，

4、因此篩選中和保護(hù)性抗體、確定其結(jié)合表位，明確其中和保護(hù)的作用機(jī)制對(duì)于研制SEB的治療性抗體具有十分重要的意義。
　　 本項(xiàng)研究旨在利用本實(shí)驗(yàn)室已獲得的具有中和保護(hù)作用抗SEB的單克隆抗體的前提下，進(jìn)一步通過(guò)鼠源3E2與SEB的共結(jié)晶，解析了SEB與中和保護(hù)抗體的作用界面，明確了SEB與鼠源3E2抗體結(jié)合表位的關(guān)鍵位點(diǎn)，初步闡明其中和保護(hù)作用的機(jī)制;進(jìn)一步采用基因工程方法構(gòu)建高效的雙可變區(qū)(DVD)可同時(shí)中和SEB MHC和TCR

5、結(jié)合位點(diǎn)的中和性抗體3E2-4A3，研究主要包括三個(gè)部分:
　　 一、抗SEB中和保護(hù)性抗體的作用及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
　　 在前期的研究中，我們通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)了GST-SEB蛋白，免疫Balb/C小鼠后，采用雜交瘤技術(shù)制備了10株具有中和保護(hù)作用的鼠源性單克隆抗體，并采用噬菌體12肽庫(kù)表位淘選了其中具有較高結(jié)合力的四株抗體，初步確定了m4A3、m3C1結(jié)合于SEB的TCR功能域，m3E2抗體結(jié)合于SEB的MH

6、CⅡ類分子功能域，m1A5結(jié)合于MHCⅡ類分子功能域的附近。m3E2抗體的親和力略高于其它三株。
　　 為了進(jìn)一步確定m3E2抗體的中和保護(hù)作用的中和表位，我們將m3E2抗體與SEB做了共結(jié)晶，通過(guò)解析發(fā)現(xiàn)m3E2抗體主要結(jié)合于SEB MHCⅡ類分子的結(jié)合功能域44FLYF47和71KDLADK76。我們將這幾處位置的氨基酸做了定點(diǎn)突變并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了突變體蛋白，通過(guò)ELISA、Western blot、3H增殖

7、實(shí)驗(yàn)及體外抑制細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)，證實(shí)SEB46Y和71K為m3E2與其結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。進(jìn)一步我們分別將46Y突變成E/F/L/M，將71K突變成N/Q/R，通過(guò)Biacore測(cè)定其親和力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)46Y突變成E（谷氨酸）、Q（谷氨酰胺）時(shí)，SEB與m3E2不結(jié)合;當(dāng)突變成F（苯丙氨酸）、M（甲硫氨酸）和R（精氨酸）時(shí)，親和力基本無(wú)變化，提示局部維持疏水環(huán)境對(duì)維護(hù)m3E2與SEB的緊密結(jié)合具有重要作用;而當(dāng)71K突變成L（亮氨酸）、N

8、（天冬氨酸）時(shí)，親和力分別由原來(lái)的5.7E-10下降至3.14E-8和1.41E-6。46Y的突變結(jié)果提示局部維持疏水環(huán)境對(duì)維護(hù)m3E2與SEB的緊密結(jié)合具有重要作用，71K的突變結(jié)果說(shuō)明局部正電荷環(huán)境對(duì)抗原抗體間的親和力變化具有重要的意義。
　　 二、抗SEB中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用
　　 為了探討鼠源抗SEB中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用，我們將m3E2與其他三株中和保護(hù)性抗體進(jìn)行了組合分組，通過(guò)3H增殖實(shí)驗(yàn)和體外抑制細(xì)胞

9、因子釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用達(dá)到73％，m3E2+m3C1的抑制效率為68％，而單用這三株抗體的抑制率平均在60％左右;m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞因子IL-2、INF-γ、 TNF-α釋放的抑制作用分別達(dá)到67.4％、68.8％和69％，m3E2+m3C1組的抑制效率為59.7％、64％、61.4％，而它們單用的抑制率平均僅有40％左右，表明m3E2+m4A3和m3E2+m3C1這兩組針對(duì)SE

10、B不同功能域的抗體聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，且m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用的效果明顯優(yōu)于m3E2+m3C1。而其它幾組針對(duì)SEB相同功能域的抗體聯(lián)合應(yīng)用后，T細(xì)胞增殖的抑制率在50％左右，對(duì)細(xì)胞因子釋放的抑制作用僅在32％左右，說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用不同功能域的抗體，對(duì)SEB的中和保護(hù)作用具有協(xié)同作用，而相同功能域的協(xié)同作用不顯著。
　　 三、高效抗SEB雙可變區(qū)抗體的構(gòu)建及功能鑒定
　　 采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了兩種結(jié)構(gòu)的DVD抗體3

11、E2-4A3和4A3-3E2，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，瞬轉(zhuǎn)結(jié)果顯示，DVD3E2-4A3的結(jié)合活性要優(yōu)于DVD4A3-3E2。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，DVD3E2-4A3抗體的體內(nèi)外中和活性均強(qiáng)于單個(gè)親源抗體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)DVD抗體較單個(gè)親源抗體具有更高的親和力（10倍），說(shuō)明其高效的優(yōu)勢(shì)不僅是通過(guò)對(duì)MHCⅡ和TCR功能域的雙阻斷，而且由于其更高的親和力，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SEB的高效的中和保護(hù)作用。
　　 本研究在前期獲得了10株SEB特異性單克隆抗體的

12、基礎(chǔ)上，通過(guò)m3E2和SEB蛋白的共結(jié)晶，解析了SEB與抗體的作用界面，通過(guò)定點(diǎn)突變證實(shí)SEB46Y和71K為m3E2與其結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，探討了抗SEB抗體中和保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);進(jìn)一步比較了幾株中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同功能域的抗體之間具有協(xié)同作用，而同一功能域的中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用不顯著;在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建獲得了可同時(shí)結(jié)合SEB TCR和MHCⅡ不同功能域的高效雙可變區(qū)抗體DVD3E2-4A3，并證實(shí)其中和保護(hù)作用優(yōu)