人源性抗FGF-2中和性抗體的篩選，表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的和背景：
　　 FGF-2又稱為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2),是成纖維生長(zhǎng)因子家族的一員,最早由Gospodarowicz(1974)從牛腦垂體中提取的一種對(duì)BALB/C 3T3細(xì)胞等有明顯促進(jìn)生長(zhǎng)作用的細(xì)胞因子。FGF-2有五種分子量,從18kD到34kD不等。所有的FGF-2異構(gòu)體都缺乏信號(hào)肽,是通過一種現(xiàn)在還不十分清楚的機(jī)制分泌到細(xì)胞外的,其中18kD FGF-2在體內(nèi)分布廣泛,存在于中胚層及神經(jīng)外胚層來源的細(xì)

2、胞及多種腫痛細(xì)胞中,對(duì)這些細(xì)胞有促增殖分化功能,參與了胚胎發(fā)育、血管生成、損傷修復(fù)、神經(jīng)再生、腫瘤生長(zhǎng)、組織纖維化等多項(xiàng)生理及病理過程。
　　 FGF-2的生物學(xué)效應(yīng),除對(duì)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的促增殖作用外,還參與腫痛發(fā)生和發(fā)展,特別對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移具有重要作用。有相當(dāng)部分的腫瘤(如乳痛、結(jié)腸痛、甲狀腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等)存在FGF-2的高表達(dá)(表2)。已知其作用環(huán)節(jié)主要有(1)FGF-2能促進(jìn)表皮、內(nèi)皮細(xì)

3、胞再生,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)其從基膜中分離出來,以刺激內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織趨化運(yùn)動(dòng),并形成管狀結(jié)構(gòu),還提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子類及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他蛋白酶,從而促進(jìn)毛細(xì)血管的形成；(2)FGF-2能促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子的分泌,如VEGF、HGF、FGF-1等,這些因子相互調(diào)節(jié),共同促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；(3)腫瘤細(xì)胞存在FGF-2受體的高表達(dá),通常比正常細(xì)胞上FGF-2R高10倍以上,許多腫瘤細(xì)胞(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉痛、白血

4、病、肺痛、黑色素瘤、肝癌等)既表達(dá)FGF2又表達(dá)FGFRs,因此FGF2可直接作用于腫痛細(xì)胞,使腫瘤組織的各種蛋白酶及膠原酸分泌增加,從而加速腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程；(4)FGF-2還與腫瘤的耐藥性有關(guān),增強(qiáng)腫瘤對(duì)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗能力[20]。
　　 FGF-2與腫瘤腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥有關(guān),用抗體阻斷FGF-2的活性被認(rèn)為是一種治療腫瘤的有效方法。已有多株抗FGF-2抗體體內(nèi)外抑制腫瘤試驗(yàn)的報(bào)道。在多種動(dòng)物體內(nèi),一株中和性

5、的的單抗(GD2)能抑制FGF-2或腫瘤組織誘導(dǎo)的血管新生。在大鼠體內(nèi)內(nèi)GD2能抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)。另一株單抗,3H3,能抑制十二指腸潰瘍的血管新生,從而延遲潰瘍的愈合,同時(shí)它還能抑制一種轉(zhuǎn)染的致瘤性細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。Aonuma等制備了兩株中和性單抗,2G11和1E6,前者識(shí)別的是FGF-2的肝素結(jié)合位點(diǎn),后者識(shí)別的是FGF-2與受體結(jié)合的位點(diǎn),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)1E6能抑制腫瘤生長(zhǎng),而2G11不具備抗瘤作用。國(guó)內(nèi),謝慶祥等[7]通過建立

6、裸鼠皮下移植膀胱癌動(dòng)物模型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)FGF-2抗體治療組皮下瘤體積和重量比對(duì)照組均顯著減少,瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)指數(shù)和微血管密度(MVD)也顯著降低,表明FGF-2抗體對(duì)膀胱痛的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用,其主要通過抑制膀胱痛細(xì)胞增殖和減少腫瘤血管形成的途徑而在荷痛裸鼠體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。林衛(wèi)等觀察了FGF-2抗體對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的增殖、卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠的生存率和人卵巢癌移植瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果顯示,FGF

7、-2抗體能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,卵巢癌的生長(zhǎng)和血管生成,并呈濃度依賴性,提示FGF-2單抗有望成為卵巢癌生物治療的新方法。本實(shí)驗(yàn)室前期制備了19株鼠抗FGF-2單抗,通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),其中三株抗體能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡,近期的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中一株抗體能夠明顯抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,同時(shí)與化療藥物順鉑、紫杉醇等聯(lián)合使用能夠明顯抑制黑色素瘤的生長(zhǎng),而對(duì)于那些對(duì)化療藥物耐藥的腫瘤抗FGF-2單抗能逆轉(zhuǎn)其耐藥性。

8、r>　　 這些報(bào)道證實(shí)在多種試驗(yàn)條件下,抗FGF-2抗體能阻斷血管新生和抑制腫瘤生長(zhǎng)。但這些抗體都是動(dòng)物來源的抗體,用于人類疾病的治療存在半衰期短、血清病發(fā)生率高、易在人體內(nèi)產(chǎn)生抗體導(dǎo)致不能重復(fù)使用等弊。制備全人源性的抗FGF-2抗體,是克服上述弊端有效方法。
　　 人源性抗體的制備技術(shù)主要有三種,第一種是通過表面展示技術(shù)從人源性抗體庫(kù)中篩選人源性抗體,第二種技術(shù)是通過免疫轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因鼠來獲得針對(duì)特異抗原的人源

9、性抗體,第三種技術(shù)是通過細(xì)胞分選技術(shù),從某些病人骨髓細(xì)胞或外周血細(xì)胞中篩選特異性針對(duì)某種抗原的B細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞,通過某些技術(shù)如與人骨髓瘤融合或用EB病毒使其永生化,使得這些B細(xì)胞能在體外無限繁殖,從而分泌人源性抗體。這三種技術(shù)中第二種技術(shù)需要購(gòu)買或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,需要耗費(fèi)大量財(cái)力和物力。第三種技術(shù)需要特殊病人的血細(xì)胞,并且需要獲得人源性雜交瘤或刺激B細(xì)胞的永生化,這些技術(shù)目前還不成熟。表面展示技術(shù)具有極強(qiáng)的篩選功能,將序列互不相同的

10、一組多樣化的抗體表達(dá)到細(xì)菌,酵母,病毒表面,得到抗體展示庫(kù)因此,利用其表型與基因型的統(tǒng)一以及易于擴(kuò)增的特性,可很容易的從庫(kù)中篩選出針對(duì)某種特異抗原的抗體。
　　 從噬菌體抗體庫(kù)中直接篩選獲得高親和力抗體,其主要影響因素是抗體庫(kù)容量大小和抗體基因的成熟度,其多樣性要能保證有這種抗體存,并且在經(jīng)過擴(kuò)增后具有被篩選出來所要求的拷貝數(shù),因此增加噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容量尤其重要。根據(jù)已有報(bào)道,從大于109的大容量天然抗體庫(kù)中,往往可以得到高親

11、和力的抗體,無需進(jìn)行抗體親和力成熟。本研究所用的抗體庫(kù)為經(jīng)過單載體細(xì)胞內(nèi)重組法(Lxop-cre定位重組系統(tǒng))兩次重組配對(duì)后的人源性大容量抗體庫(kù),重組后庫(kù)容約為6×1010,沉淀濃縮后滴度約為1013cfu/ml,具有良好的多樣性,可以充分滿足篩選的需要,在獲得高親和力抗體以及進(jìn)行抗體性能改造方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
　　 在抗體的進(jìn)化過程中,基因突變并不是隨機(jī)發(fā)生于可變區(qū)內(nèi)的,而是傾向性的集中在CDR區(qū)的某些位置,即突變熱點(diǎn),有多

12、種類型,其中研究較詳細(xì)的熱點(diǎn)類型有AGY/RGYW和TAY(R=A/G,Y=C/T,W=A/T)。這些位點(diǎn)也常常是位于和抗原直接結(jié)合的區(qū)域中。針對(duì)這類位點(diǎn)引入突變,相較于這類位點(diǎn)之外的區(qū)域?qū)⒏赡艿玫接H和力提高的基因工程抗體,而且可以通過構(gòu)建小型的突變庫(kù)來實(shí)現(xiàn)。Ho等研究發(fā)現(xiàn),CDR區(qū)的突變熱點(diǎn)分為胚系熱點(diǎn)和非胚系熱點(diǎn),只有突變胚系熱點(diǎn)才能提高抗體的親和力。
　　 方法
　　 1.利用固相篩選技術(shù)從大容量噬菌體抗體庫(kù)(6

13、×1010)中篩選能特異性結(jié)FGF-2的克隆,經(jīng)過三到四輪的洗脫篩選,將得到的陽(yáng)性克隆通過酶切鑒定,可變區(qū)多樣性分析,基因測(cè)序和序列比對(duì),確定能特異性結(jié)合FGF-2的序列正確的陽(yáng)性克隆。
　　 2.將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆的基因插入到原核表達(dá)載體pComb3XSS中,在低溫培養(yǎng)條件下,利用IPTG誘導(dǎo)scFv基因的可溶性表達(dá),離心后收集菌體,PBS重懸后超聲破碎,收集破碎上清,通過SDS-PAGE,Western-blot,ELIS

14、A鑒定上清中抗體的特異性,通過競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)者幾株scFv能否抑制FGF-2與其高親和力受體FGFR1的結(jié)合。
　　 3.將能夠抑制FGF-2與其高親和力受體FGFR1的結(jié)合的44克隆通過重疊延伸PCR構(gòu)建成全長(zhǎng)的人源性抗FGF-2抗體,插入到真核表達(dá)載體pIGG 中,構(gòu)建成真和表達(dá)載體pIGG-44,利用轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,進(jìn)行真核可溶性表達(dá),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過SDS-PAGE,Weste

15、rn-blot,ELISA鑒定上清中抗體的特異性,通過硫酸銨沉淀和蛋白G純化抗體,通過夾心ELISA測(cè)定抗體的濃度。
　　 4.表達(dá)的全長(zhǎng)的人源性抗體通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體的中和FGF-2的活性,通過血管內(nèi)皮細(xì)胞促增值實(shí)驗(yàn),遷移實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,通過腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)驗(yàn)證抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用,通過Hoechst 33258染色觀察抗體作用后腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核的變化情況,來觀察細(xì)胞是否發(fā)上了凋亡。

16、
　　 5.對(duì)具有中和活性的44號(hào)克隆進(jìn)行親和力成熟,利用基因比對(duì)從Genebank中搜索出與44號(hào)克隆序列最接近的抗體胚系基因序列,然后通過IMTG中的抗體可變區(qū)基因在線分析工具V-QUEST,找出重鏈胚系基因中CDR區(qū)的突變熱點(diǎn),并與44號(hào)克隆進(jìn)行比較,確定這些熱點(diǎn)在44號(hào)克隆重鏈CDR區(qū)中的位置,隨后我們通過定點(diǎn)突變對(duì)重鏈可變區(qū)CDR1區(qū)中的三個(gè)胚系熱點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變,構(gòu)建噬菌體抗體突變庫(kù),通過三輪洗脫篩選,每輪逐漸增加

17、洗脫次數(shù)和減少包被的FGF-2的量來得到親和力提高的抗體突變株,將高親和力突變株進(jìn)行可溶性表達(dá)后,通過異硫氰酸銨洗脫法測(cè)定抗體的相對(duì)親和力。
　　 結(jié)論
　　 1.通過對(duì)人源性噬菌體抗體庫(kù)的篩選得到了七株不同的人源性抗FGF-2抗體,經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中一株抗體能夠中和FGF-2的多種生物學(xué)作用,如促血管內(nèi)皮增殖作用,促細(xì)胞遷移作用,內(nèi)皮細(xì)胞成管作用等,更為重要的此株抗體還能誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG的凋亡。

18、　　 2.通過胚系熱點(diǎn)突變使此株中和性抗體的親和力提高了4倍,與此同時(shí)也提高了抗體的中和活性,從而證實(shí)了胚系熱點(diǎn)突變提高抗體親和力的可行性。
　　 本研究的創(chuàng)新處:
　　 1.成功篩選到三株人源性中和性抗FGF-2抗體,其中一株的抑制FGF-2與其高親和力受體FGFR1結(jié)合的效果最好,通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)此株抗體能夠中和FGF-2的多種生物學(xué)作用,為FGF-2抗體藥物研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2.成功利用CDR區(qū)胚系熱