納秒脈沖電場誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡及相關(guān)機理研究.pdf

1、惡性腫瘤已成為目前危害人類身體健康最嚴(yán)重的疾病之一。外科手術(shù),化療,放療等傳統(tǒng)的各種治療手段都存在不同程度的缺陷,電化學(xué)療法在通過電場作用增加細胞或腫瘤組織的透化作用的情況下,降低用藥量的同時提高了治療效果,但仍不能完全避免藥物對機體的毒副作用。納秒級脈沖電場刺激(nsPEFs)是一種殺傷腫瘤細胞的新方法。已有的研究表明,nsPEFs可以在多種類型的細胞中作用于細胞膜結(jié)構(gòu)并對凋亡信號產(chǎn)生誘導(dǎo)作用從而導(dǎo)致細胞凋亡。但具體的作用機制,作用部

2、位以及凋亡通路還不明確。在本文的研究中,我們用場強為10kV/cm,脈寬為500ns,頻率1Hz的脈沖電場對人肝癌細胞HepG2施加不同時間的刺激,通過細胞凋亡效率檢測,形態(tài)學(xué)觀察,細胞膜的通透性、線粒體跨膜電位的變化,及細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)因子和鈣離子的研究來探索電場的生物學(xué)效應(yīng)及可能的凋亡機理。以期為癌癥特別是肝癌的脈沖電場治療或其他的相關(guān)研究提供理論依據(jù)和參考。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　?、俜謩e對細胞施加0、10、20、30

3、及60個脈沖電場刺激后,用AnnexinV-FITC和PI雙染的方法結(jié)合流式細胞技術(shù)進行凋亡率檢測。結(jié)果表明,隨著刺激時間的增加,細胞凋亡比例也隨之增加,nsPEFs在誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2早期凋亡方面具有明顯效果。
　?、谕ㄟ^透射電鏡對經(jīng)過脈沖電場刺激后的實驗組細胞和未經(jīng)電場刺激的對照組細胞進行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過電場刺激后的細胞,出現(xiàn)了如核仁消失,核染色質(zhì)固縮、核膜皺褶甚至消失的現(xiàn)象,出現(xiàn)凋亡小體等典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。結(jié)

4、果表明電場刺激能夠誘導(dǎo)細胞凋亡,且隨著電場刺激時間的增加,凋亡效果呈增長趨勢,但120s的電場刺激會導(dǎo)致細胞大量溶解性壞死。
　?、弁ㄟ^碘化丙啶(PI)探針對細胞進行染色,結(jié)合熒光倒置相差顯微鏡對電場刺激后的細胞膜通透性(電穿孔)進行觀察發(fā)現(xiàn):施加電場能量越高,細胞“穿孔”越快,比例越大。同時,本文通過對這種nsPEFs引起的“穿孔”是否恢復(fù)的實驗檢測,結(jié)果顯示,到電場刺激后4h,PI紅色熒光還非常強,細胞穿孔未見明顯恢復(fù),因此,

5、本文所用的脈沖電場刺激誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生的“穿孔”是不可逆的。
　?、芡ㄟ^羅丹明123對細胞進行染色,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對電場刺激后的細胞線粒體膜電位進行實時觀測,結(jié)果顯示:細胞受到脈沖電場刺激后的幾秒鐘內(nèi)即出現(xiàn)線粒體膜電位下降的現(xiàn)象,但兩個實驗組(20s,60s)之間沒有明顯差別。接下來通過JC-1熒光探針結(jié)合熒光光譜儀對電場刺激后的細胞膜電位進行檢測,分別在電場刺激后1h,2h和4h檢測結(jié)果,各時間點檢測結(jié)果顯示:細胞受到電

6、場刺激后,隨著刺激時間的增加,線粒體膜電位呈下降趨勢,且20s組和60s組相對于對照組均有顯著性差異。但隨著時間的推移,各實驗組細胞線粒體膜電位呈向正常水平恢復(fù)的趨勢,到4h的時候,20s實驗組細胞的線粒體膜電位已臨近正常水平。
　?、萃ㄟ^Fluo-3AM探針對細胞染色,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對不同時間(20s、60s)脈沖電場刺激后的細胞胞內(nèi)鈣離子濃度進行實時觀測結(jié)果顯示:nsPEF刺激能誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子,胞內(nèi)鈣離子濃度迅速

7、增加,峰值分別達到刺激前的3.192倍(20s)和1.746倍(60s)。通過熒光光譜儀對電場刺激后的細胞胞內(nèi)鈣離子檢測發(fā)現(xiàn),1h后胞內(nèi)鈣離子水平已基本達到穩(wěn)定狀態(tài),20s組細胞胞內(nèi)鈣離子濃度恢復(fù)至正常水平,而60s電場刺激后的細胞樣品,胞內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對照組和20s刺激組。表明不同參數(shù)的電場刺激可影響胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)。
　?、尥ㄟ^實時定量PCR和western-blot的方法對電場刺激后的細胞凋亡相關(guān)因子的變化進行了檢測,