豬附紅細(xì)胞體吉林株單克隆抗體的制備應(yīng)用和免疫蛋白組學(xué)研究.pdf

1、附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是由寄生于血液內(nèi)的原核生物——附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)引起的一類不易引起重視，但具有潛在威脅的新發(fā)人獸共患病。該病可導(dǎo)致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，動(dòng)物生育力下降，具有流行廣泛、隱性感染、慢性遷延和條件致病等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類身心健康。我國(guó)是目前豬附紅細(xì)胞體病流行最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，幾乎所有的省(自治區(qū))均有報(bào)道。雖然，國(guó)內(nèi)外對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的研究取得了一定進(jìn)展，但

2、到目前為止對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的防治仍無有效措施。因此，本研究克隆了豬附紅細(xì)胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因；建立了SYBR Green熒光定量PCR方法；制備了2株抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體，并對(duì)單抗的抗體亞型、特異性、細(xì)胞定位和中和特性等方面進(jìn)行了鑒定和分析；應(yīng)用制備的單抗建立了雙抗體夾心ELISA診斷方法；應(yīng)用感染血清和單抗篩選免疫原性蛋白，并對(duì)免疫原性蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，以期為豬附紅細(xì)胞體病的防制研究奠定基礎(chǔ)。
　　1、豬

3、附紅細(xì)胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因的克隆和生物信息學(xué)分析。根據(jù)GenBank中豬附紅細(xì)胞體HSPA1基因和α-Eno基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物，以豬附紅細(xì)胞體的DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將目的基因克隆到pMD-18T-simple載體后，進(jìn)行序列測(cè)定及分析。結(jié)果顯示，所克隆的HSPA1基因由1044個(gè)核苷酸組成，編碼333個(gè)氨基酸。與GenBank上發(fā)表的豬附紅細(xì)胞體HSPA1基因序列（AM265536）同源性97％，該

4、基因與血巴爾通氏體同源性最近（68.4%）。HSPA1基因編碼蛋白等電點(diǎn)為4.69，存在跨膜區(qū)。豬附紅細(xì)胞體α-Eno基因序列編碼393個(gè)氨基酸，與GenBank上登錄的α-Eno序列核苷酸同源性為98%，氨基酸同源性為100%。所克隆的α-Eno基因序列與牛支原體的親緣關(guān)系最近，與犬霉形體親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。本研究旨在從分子角度了解豬附紅細(xì)胞體吉林株的生物學(xué)特性，為豬附紅細(xì)胞體病的分子診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　2、豬附紅細(xì)胞體SY

5、BR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法建立。根據(jù)豬附紅細(xì)胞體α-Eno基因序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物。利用 SYBR GreenⅠ染料進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。然后用已建立的SYBR Green熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法對(duì)49份臨床樣本進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)相關(guān)系數(shù)為0.894，檢測(cè)極限約為1.44拷貝/μL。特異性分析表明只有豬附紅細(xì)胞體能檢測(cè)到

6、特異性的熔解度峰值，而弓形蟲、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等DNA樣本未檢測(cè)到特異性的熔解度峰值。組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)和穩(wěn)定性系數(shù)的CV值均小于5%。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，所建立的熒光定量 PCR方法檢測(cè)的陽性率（40.8%）比常規(guī) PCR方法檢測(cè)的陽性率（30.6%）高10.2%。結(jié)果表明，本研究所建立的α-Eno基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好。該方法的建立將為豬附紅細(xì)胞體病的診斷和防控

7、提供重要的技術(shù)支持。
　　3、抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體的制備和鑒定。以純化的豬附紅細(xì)胞體裂解抗原免疫6 w雌性 BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選能穩(wěn)定分泌抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)制備出單抗的抗體亞類和抗體特異性進(jìn)行鑒定。激光掃描共聚焦技術(shù)觀察單抗所識(shí)別抗原的細(xì)胞定位。應(yīng)用所建立的SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法，評(píng)估單抗對(duì)小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)豬附紅細(xì)胞體

8、的中和效果。結(jié)果顯示：試驗(yàn)成功篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3F7和2C4。誘生小鼠腹水產(chǎn)生的抗體效價(jià)可達(dá)1:16000和1:14000?？贵w亞類鑒定結(jié)果顯示所獲得2株單抗均為 IgG2a亞型。Western-blot分析表明，3F7株單抗可識(shí)別40 ku蛋白抗原，2C4株單抗可識(shí)別33 ku蛋白抗原。Western-blot鑒定結(jié)果表明2株單抗均能特異性地與豬附紅細(xì)胞體抗原結(jié)合，而與弓形蟲、豬鏈

9、球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原均不發(fā)生交叉反應(yīng)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，所制備單抗可以識(shí)別豬附紅細(xì)胞體抗原蛋白。體內(nèi)中和試驗(yàn)顯示，2株單抗中的3F7株單抗對(duì)小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)人工感染的豬附紅細(xì)胞體增殖具有一定抑制作用。2株抗豬附紅細(xì)胞體單抗的成功制備和鑒定，將為豬附紅細(xì)胞體病的快速檢測(cè)和防治奠定基礎(chǔ)。
　　4、豬附紅細(xì)胞體雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用。為建立方便快捷的豬附紅細(xì)胞體血清學(xué)檢測(cè)方法，本研

10、究以抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體為捕獲抗體，兔抗豬附紅細(xì)胞體多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立豬附紅細(xì)胞體雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法的最佳工作條件為：3F7株抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體的包被濃度為5.42 mg/L，兔抗豬附紅細(xì)胞體多克隆抗體濃度和酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)分別為6.84 mg/L和1:2000，以 OD492nm值＞0.290作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。該ELISA方法對(duì)弓形蟲、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等均無

11、交叉反應(yīng)；其重復(fù)性變異系數(shù)小于10%；敏感度可達(dá)3.25 mg/L。采用建立的ELISA方法與血涂片染色鏡檢方法同時(shí)檢測(cè)68份臨床樣品，雙抗體夾心ELISA檢測(cè)的陽性率為29.4%，比血涂片染色鏡檢方法檢測(cè)的陽性率高10.3%。本研究建立的豬附紅細(xì)胞體雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性好、成本低及方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可以用于豬附紅細(xì)胞體的快速檢測(cè)。
　　5、豬附紅細(xì)胞體吉林株免疫蛋白組學(xué)研究。為了篩選和鑒定豬附紅細(xì)胞體吉

12、林株免疫原性蛋白。采用二維電泳分析豬附紅細(xì)胞體蛋白質(zhì)表達(dá)譜，應(yīng)用感染血清和3F7株單抗與豬附紅細(xì)胞體2-DE凝膠進(jìn)行免疫印跡，并對(duì)篩選出的豬附紅細(xì)胞體免疫原性蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示：以上樣量為850μg豬附紅細(xì)胞體蛋白在13 cm、pH3～10的IPG膠條上進(jìn)行電泳，最后用考馬斯亮藍(lán) G-250染色，獲得了較好的雙向電泳圖譜。2-DE圖譜中共檢測(cè)到60±5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白主要集中在pH值6～9和分子量45 ku～25 ku范圍內(nèi)。豬

13、附紅細(xì)胞體蛋白質(zhì)表達(dá)譜中的9個(gè)蛋白點(diǎn)被豬附紅細(xì)胞體感染血清和3F7株單抗所識(shí)別，5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被成功鑒定,其中2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定為支原體已知蛋白（ATP結(jié)合蛋白和膽堿激酶），3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定為由豬附紅細(xì)胞體基因組序列推測(cè)的假定蛋白（假定蛋白Msui05020、假定蛋白Msui06340和假定蛋白CAG:472）。3F7株單抗識(shí)別的蛋白經(jīng)鑒定為ATP結(jié)合蛋白。本研究將為進(jìn)一步開展豬附紅細(xì)胞體診斷和疫苗候選分子研究奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：<

14、br>　　1、應(yīng)用PCR技術(shù)，成功克隆了豬附紅細(xì)胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因，并對(duì)所克隆的目的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　2、成功建立了豬附紅細(xì)胞體SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。
　　3、成功制備了2株抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，所制備單抗可以識(shí)別豬附紅細(xì)胞體抗原蛋白。2株單抗中的3F7株單抗對(duì)小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)人工感染的豬附紅細(xì)胞體