豬附紅細胞體吉林株單克隆抗體的制備應用和免疫蛋白組學研究.pdf

1、附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是由寄生于血液內(nèi)的原核生物——附紅細胞體(Eperythrozoon)引起的一類不易引起重視，但具有潛在威脅的新發(fā)人獸共患病。該病可導致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，動物生育力下降，具有流行廣泛、隱性感染、慢性遷延和條件致病等特點，嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類身心健康。我國是目前豬附紅細胞體病流行最為嚴重的國家之一，幾乎所有的省(自治區(qū))均有報道。雖然，國內(nèi)外對豬附紅細胞體病的研究取得了一定進展，但

2、到目前為止對豬附紅細胞體病的防治仍無有效措施。因此，本研究克隆了豬附紅細胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因；建立了SYBR Green熒光定量PCR方法；制備了2株抗豬附紅細胞體單克隆抗體，并對單抗的抗體亞型、特異性、細胞定位和中和特性等方面進行了鑒定和分析；應用制備的單抗建立了雙抗體夾心ELISA診斷方法；應用感染血清和單抗篩選免疫原性蛋白，并對免疫原性蛋白進行質(zhì)譜鑒定，以期為豬附紅細胞體病的防制研究奠定基礎。
　　1、豬

3、附紅細胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因的克隆和生物信息學分析。根據(jù)GenBank中豬附紅細胞體HSPA1基因和α-Eno基因的DNA序列設計引物，以豬附紅細胞體的DNA為模板，進行 PCR擴增，將目的基因克隆到pMD-18T-simple載體后，進行序列測定及分析。結果顯示，所克隆的HSPA1基因由1044個核苷酸組成，編碼333個氨基酸。與GenBank上發(fā)表的豬附紅細胞體HSPA1基因序列（AM265536）同源性97％，該

4、基因與血巴爾通氏體同源性最近（68.4%）。HSPA1基因編碼蛋白等電點為4.69，存在跨膜區(qū)。豬附紅細胞體α-Eno基因序列編碼393個氨基酸，與GenBank上登錄的α-Eno序列核苷酸同源性為98%，氨基酸同源性為100%。所克隆的α-Eno基因序列與牛支原體的親緣關系最近，與犬霉形體親緣關系最遠。本研究旨在從分子角度了解豬附紅細胞體吉林株的生物學特性，為豬附紅細胞體病的分子診斷和防治提供科學依據(jù)。
　　2、豬附紅細胞體SY

5、BR Green熒光定量PCR檢測方法建立。根據(jù)豬附紅細胞體α-Eno基因序列，設計了1對特異性引物。利用 SYBR GreenⅠ染料進行Real-time PCR反應，建立標準曲線，并進行敏感性試驗、特異性試驗和重復性試驗。然后用已建立的SYBR Green熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法對49份臨床樣本進行平行檢測。結果顯示，標準曲線的反應相關系數(shù)為0.894，檢測極限約為1.44拷貝/μL。特異性分析表明只有豬附紅細胞體能檢測到

6、特異性的熔解度峰值，而弓形蟲、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等DNA樣本未檢測到特異性的熔解度峰值。組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)和穩(wěn)定性系數(shù)的CV值均小于5%。臨床樣本檢測結果顯示，所建立的熒光定量 PCR方法檢測的陽性率（40.8%）比常規(guī) PCR方法檢測的陽性率（30.6%）高10.2%。結果表明，本研究所建立的α-Eno基因?qū)崟r熒光定量PCR方法靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好。該方法的建立將為豬附紅細胞體病的診斷和防控

7、提供重要的技術支持。
　　3、抗豬附紅細胞體單克隆抗體的制備和鑒定。以純化的豬附紅細胞體裂解抗原免疫6 w雌性 BALB/c小鼠，取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選能穩(wěn)定分泌抗豬附紅細胞體單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對制備出單抗的抗體亞類和抗體特異性進行鑒定。激光掃描共聚焦技術觀察單抗所識別抗原的細胞定位。應用所建立的SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，評估單抗對小鼠動物模型體內(nèi)豬附紅細胞體

8、的中和效果。結果顯示：試驗成功篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗豬附紅細胞體單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為3F7和2C4。誘生小鼠腹水產(chǎn)生的抗體效價可達1:16000和1:14000?？贵w亞類鑒定結果顯示所獲得2株單抗均為 IgG2a亞型。Western-blot分析表明，3F7株單抗可識別40 ku蛋白抗原，2C4株單抗可識別33 ku蛋白抗原。Western-blot鑒定結果表明2株單抗均能特異性地與豬附紅細胞體抗原結合，而與弓形蟲、豬鏈

9、球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原均不發(fā)生交叉反應。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，所制備單抗可以識別豬附紅細胞體抗原蛋白。體內(nèi)中和試驗顯示，2株單抗中的3F7株單抗對小鼠動物模型體內(nèi)人工感染的豬附紅細胞體增殖具有一定抑制作用。2株抗豬附紅細胞體單抗的成功制備和鑒定，將為豬附紅細胞體病的快速檢測和防治奠定基礎。
　　4、豬附紅細胞體雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立和應用。為建立方便快捷的豬附紅細胞體血清學檢測方法，本研

10、究以抗豬附紅細胞體單克隆抗體為捕獲抗體，兔抗豬附紅細胞體多克隆抗體為檢測抗體，建立豬附紅細胞體雙抗體夾心ELISA檢測方法。結果顯示，該方法的最佳工作條件為：3F7株抗豬附紅細胞體單克隆抗體的包被濃度為5.42 mg/L，兔抗豬附紅細胞體多克隆抗體濃度和酶標抗體的稀釋倍數(shù)分別為6.84 mg/L和1:2000，以 OD492nm值＞0.290作為陽性判定標準。該ELISA方法對弓形蟲、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等均無

11、交叉反應；其重復性變異系數(shù)小于10%；敏感度可達3.25 mg/L。采用建立的ELISA方法與血涂片染色鏡檢方法同時檢測68份臨床樣品，雙抗體夾心ELISA檢測的陽性率為29.4%，比血涂片染色鏡檢方法檢測的陽性率高10.3%。本研究建立的豬附紅細胞體雙抗體夾心ELISA檢測方法具有敏感性高、特異性好、成本低及方便快捷等優(yōu)點，可以用于豬附紅細胞體的快速檢測。
　　5、豬附紅細胞體吉林株免疫蛋白組學研究。為了篩選和鑒定豬附紅細胞體吉

12、林株免疫原性蛋白。采用二維電泳分析豬附紅細胞體蛋白質(zhì)表達譜，應用感染血清和3F7株單抗與豬附紅細胞體2-DE凝膠進行免疫印跡，并對篩選出的豬附紅細胞體免疫原性蛋白進行質(zhì)譜鑒定。結果顯示：以上樣量為850μg豬附紅細胞體蛋白在13 cm、pH3～10的IPG膠條上進行電泳，最后用考馬斯亮藍 G-250染色，獲得了較好的雙向電泳圖譜。2-DE圖譜中共檢測到60±5個蛋白質(zhì)點，蛋白主要集中在pH值6～9和分子量45 ku～25 ku范圍內(nèi)。豬

13、附紅細胞體蛋白質(zhì)表達譜中的9個蛋白點被豬附紅細胞體感染血清和3F7株單抗所識別，5個蛋白質(zhì)點被成功鑒定,其中2個蛋白質(zhì)點鑒定為支原體已知蛋白（ATP結合蛋白和膽堿激酶），3個蛋白質(zhì)點鑒定為由豬附紅細胞體基因組序列推測的假定蛋白（假定蛋白Msui05020、假定蛋白Msui06340和假定蛋白CAG:472）。3F7株單抗識別的蛋白經(jīng)鑒定為ATP結合蛋白。本研究將為進一步開展豬附紅細胞體診斷和疫苗候選分子研究奠定基礎。
　　結論：<

14、br>　　1、應用PCR技術，成功克隆了豬附紅細胞體吉林株HSPA1基因和α-Eno基因，并對所克隆的目的基因進行了生物信息學分析。
　　2、成功建立了豬附紅細胞體SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，該方法靈敏性高、特異性強、重復性好。
　　3、成功制備了2株抗豬附紅細胞體單克隆抗體，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，所制備單抗可以識別豬附紅細胞體抗原蛋白。2株單抗中的3F7株單抗對小鼠動物模型體內(nèi)人工感染的豬附紅細胞體