StAR對軟脂酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的保護作用研究.pdf

1、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是膽固醇的一種轉(zhuǎn)運蛋白，主要參與膽固醇代謝，合成類固醇激素。本課題組前期研究表明StAR表達(dá)于肝臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中，具有在線粒體內(nèi)外膜間轉(zhuǎn)運膽固醇、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用。
　　血管內(nèi)皮除了維持血管壁完整外，還具有重要的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能:首先，內(nèi)皮細(xì)胞通過其生成并釋放的一氧化氮(NO)、緩激肽、內(nèi)皮素、前列環(huán)素調(diào)

2、節(jié)血管張力;其次，內(nèi)皮細(xì)胞通過相關(guān)血管活性物質(zhì)抑制炎性細(xì)胞、血小板的聚集和粘附，抑制平滑肌的增殖和遷移等。某些內(nèi)源性和外源性因子導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能異常，包括精神性和生理學(xué)應(yīng)激、動脈粥樣硬化、高血壓、老齡化、炎癥和糖尿病等疾病狀態(tài)，使內(nèi)皮從穩(wěn)定狀態(tài)變?yōu)槭胶鉅顟B(tài)，即內(nèi)皮功能發(fā)生異常，又稱內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化等心血管疾病的始發(fā)環(huán)節(jié)，是由長期暴露于心血管疾病危險因素引起的，其中最主要的危險因素是以高血脂為特征的脂質(zhì)代謝紊亂，

3、又以循環(huán)血中的高游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）對內(nèi)皮細(xì)胞的損害最為重要，也是目前該領(lǐng)域研究的熱點之一。研究表明，F(xiàn)FA水平增高可損害內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(eNOS)的活性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞依賴性的血管舒張、促進內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的釋放及誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡等。因此，針對FFA導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙的相關(guān)機制的研究，對于保護內(nèi)皮細(xì)胞功能，進一步預(yù)防和治療動脈粥樣硬化具有重要意義。綜上，本課題擬在原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)StAR

4、后，研究StAR是否對軟脂酸(palmitic acid，PA)引起的內(nèi)皮功能障礙具有保護作用。
　　本研究共包括兩部分內(nèi)容，詳細(xì)如下:
　　第一部分:類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)對原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的影響
　　我們以大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Rat aortal endothelial cell，RAEC)為研究對象，首先用動脈環(huán)法成功培養(yǎng)了大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，利用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)

5、學(xué)特征;利用細(xì)胞免疫化學(xué)方法顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面抗原標(biāo)志;其次利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，利用實時定量PCR和Wesern blot方法驗證StAR在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)，同時檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:動脈環(huán)法培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞72小時后自動脈環(huán)中爬出，具有典型血管內(nèi)皮細(xì)胞特征（鋪路石樣、管腔樣形成），CD31、vW因子等內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志表達(dá)陽性;利用腺病毒Ad-St

6、AR，以不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI=10，20，50，100)轉(zhuǎn)染RAEC，48小時后提取細(xì)胞總RNA及蛋白，StAR的mRNA及蛋白表達(dá)隨著病毒感染復(fù)數(shù)增加而遞增，結(jié)果提示利用腺病毒載體在RAEC中成功過表達(dá)StAR。其次，在腺病毒轉(zhuǎn)染48小時后，與轉(zhuǎn)染空載體組相比，過表達(dá)StAR組FAS、ACC-1、HMGR、LDLR、SREBP-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05);最后，在腺病

7、毒轉(zhuǎn)染48小時后以氯仿/異丙醇/NP-40及氯仿/TritonⅩ-100分別萃取細(xì)胞內(nèi)膽固醇及游離脂肪酸，利用膽固醇檢測試劑盒（CHO酶法）和游離脂肪酸超敏測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離脂肪酸含量，結(jié)果顯示:StAR轉(zhuǎn)染48小時后，與轉(zhuǎn)染空載體EGFP組相比，過表達(dá)StAR組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇及游離脂肪酸含量明顯降低（P＜0.05）。
　　第二部分:StAR對PA引起的內(nèi)皮功能障礙的保護作用。
　　我們以原代培養(yǎng)的大鼠主動脈

8、內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體在RAEC中過表達(dá)StAR。首先，以外源性PA為刺激因素，腺病毒轉(zhuǎn)染48小時后加入培養(yǎng)的RAEC中，于不同時間點提取細(xì)胞RNA，利用實時定量PCR檢測細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNFα、IL-6、VCAM-1的基因表達(dá);利用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子含量;同時收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞胞漿及胞核蛋白，利用Western blot方法檢測核轉(zhuǎn)錄因子NFκB在胞漿和胞核中

9、的表達(dá)。結(jié)果顯示:過表達(dá)StAR能抑制PA導(dǎo)致的炎癥因子基因表達(dá)增高及釋放增多，其作用機制是通過抑制NFκB的核轉(zhuǎn)位，從而抑制其活化，最終抑制NFκB下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，進一步減少炎癥因子釋放。其次，在腺病毒轉(zhuǎn)染RAEC48小時后加入外源性PA，在不同時間點收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，利用Western blot方法檢測p-Akt/p-eNOS信號通路的變化，并利用NO檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中NO的釋放量。結(jié)果顯示:PA能抑制p-Ak

10、t/p-eNOS/NO通路，減少NO的生成和釋放，而過表達(dá)StAR能明顯減輕PA的抑制作用，增加Akt及eNOS的磷酸化水平，增加RAEC中NO的釋放，維持血管內(nèi)皮舒縮功能的平衡。
　　綜上所述，本課題首先利用主動脈環(huán)貼壁法成功在體外培養(yǎng)了RAEC，并通過形態(tài)學(xué)及細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測證實為血管內(nèi)皮細(xì)胞;利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體可在RAEC中過表達(dá)StAR;過表達(dá)StAR可抑制RAEC中的膽固醇和脂肪酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)