APM1基因重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)軟脂酸環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：1、構(gòu)建攜帶人脂聯(lián)素基因(APM1)的重組腺病毒載體；2、觀察軟脂酸(palmitic acid，PA)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白，eNOS蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)NO水平的影響，并研究APM1基因重組腺病毒對(duì)軟脂酸環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白，eNOS蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)NO水平的影響。 方法：1、以帶有人脂聯(lián)素基因的質(zhì)粒pINCY-APM1為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人脂聯(lián)素基因APM1，并將其定向克隆于真核表達(dá)載體pD

2、C315-EGFP，與輔助質(zhì)粒pBHGlox⊿E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)位點(diǎn)特異重組包裝得到重組腺病毒Ad-APM1。通過Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)重組腺病毒Ad-APM1感染HEK293細(xì)胞后的表達(dá)。2、選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對(duì)象，通過MTT觀察軟脂酸作用后細(xì)胞的存活率；Griess化學(xué)顯色法檢測(cè)氧化損傷過程中細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)水平；同時(shí)應(yīng)用Western blot

3、技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表達(dá)水平的變化。隨后用APM1基因重組腺病毒(Ad-APM1)預(yù)處理，觀察重組脂聯(lián)素對(duì)軟脂酸環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白，eNOS蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)NO的影響。 結(jié)果：1、重組腺病毒Ad-APM1包裝成功，Real-tim

4、e PCR和Western blot可檢測(cè)到重組腺病毒Ad-APM1感染HEK293細(xì)胞后脂聯(lián)素的表達(dá)。2、MTT顯示軟脂酸(100～800μmol/L)作用不同時(shí)間后可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)效和量效關(guān)系；400μmol/L軟脂酸處理24h后引起細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)達(dá)高峰水平，同時(shí)引起細(xì)胞NO水平明顯升高：該濃度的軟脂酸處理24h時(shí)對(duì)eNOS蛋白表達(dá)影響不大，與對(duì)照組相比無明顯差異；Ad-APM1預(yù)處理預(yù)處理48h可以抑制軟

5、脂酸誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平及NO的水平，并且Ad-APM1能使HUVEC細(xì)胞eNOS蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，與對(duì)照組相比，差異均有顯著性(P<0.001)。 結(jié)論： 1、應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)同源重組方法成功構(gòu)建了攜帶人脂聯(lián)素基因的重組腺病毒。 2、軟脂酸可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平的升高，同時(shí)引起細(xì)胞NO水平的明顯升高；不同濃度的軟脂酸對(duì)HUVEC細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)水平的影響無差異性。