軟脂酸促內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究軟脂酸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制。 方法：密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)分化為EPC，經(jīng)軟脂酸刺激，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)EPC凋亡的影響；Western-blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志性蛋白caspase-3的表達(dá)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑對(duì)其影響；ELISA檢測(cè)caspase-3的活性及對(duì)EPC分泌炎性細(xì)胞因子的影響，熒光顯微鏡標(biāo)測(cè)其對(duì)活性氧的影響。并觀察通心絡(luò)對(duì)之的干預(yù)作用。

2、 結(jié)果：軟脂酸呈濃度和時(shí)間依賴性促進(jìn)EPC凋亡及上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)及活性，而這種促凋亡作用可以被p38、JnkMAPK抑制劑及通心絡(luò)(TXL)部分抑制。軟脂酸促進(jìn)EPC細(xì)胞因子TNF-α的分泌和活性氧的表達(dá)，而p38抑制劑SB203580、JnkMAPK抑制劑SP600125、通心絡(luò)可以抑制TNF-α的的分泌及活性氧的表達(dá)。 結(jié)論：軟脂酸可能通過(guò)上調(diào)EPC p38、JnkMAPK通路、促進(jìn)炎性因子TNF-α的分

3、泌和氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)caspase-3的表達(dá)及活性，促EPC的凋亡。p38抑制劑、JnkMAPK抑制劑及通心絡(luò)可能部分抑制軟脂酸的上述作用。這些發(fā)現(xiàn)可能部分解釋在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中軟脂酸和EPC所起的作用及通心絡(luò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)機(jī)制。 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothdial progenitor cell，EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可以遷移、增殖并分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮的修復(fù)及新生血管的形成。EPC在內(nèi)皮損傷和修

4、復(fù)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，EPC介導(dǎo)的損傷和修復(fù)反應(yīng)假說(shuō)已成為目前動(dòng)脈粥樣硬化研究的熱點(diǎn)。脂代謝紊亂與糖尿病引起的動(dòng)脈粥樣硬化聯(lián)系緊密，而游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)是體內(nèi)血液中血脂的重要組成，F(xiàn)FA在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用．它廣泛參與了血管內(nèi)皮功能受損的各個(gè)病理生理過(guò)程，已成為糖尿病引起的動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制之一．軟脂酸(palmitic acid，PA)是體內(nèi)FFA中主要成分之一。新近研究表明，高

5、濃度PA可以阻止血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的EPC增殖及遷移、粘附和成血管能力，促進(jìn)其老化，導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)，但其促進(jìn)EPC凋亡及具體機(jī)制研究甚少。我們已往的研究已證實(shí)中藥通心絡(luò)對(duì)EPC細(xì)胞具有保護(hù)功能，本研究通過(guò)觀察PA引起的體外培養(yǎng)的人外周血EPC凋亡的影響及與細(xì)胞分泌炎性因子的關(guān)系及相關(guān)的分子機(jī)制及通心絡(luò)的干預(yù)作用，進(jìn)一步探討FFA在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制及有效的干預(yù)手段。全文由四部分組成。 第一部分成人外周血內(nèi)皮祖

6、細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定和誘導(dǎo)分化 目的：探討健康成人外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定和誘導(dǎo)分化的條件 方法：用密度梯度離心法分離健康成人單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，經(jīng)含30ng/ml重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinant Human Vascular Endothelial CellGrowth Factor，rh-VEGF)、6ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(RecombinantHuman basi

7、c fibroblast growth factor，rh-b-FGF)和10％胎牛血清(Fetus CalfSerum，F(xiàn)CS)的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)以及集落、梭形貼壁細(xì)胞的出現(xiàn)時(shí)間，并在第7天收集貼壁細(xì)胞，激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser ScanningConfocal Microscope，LSCM)和流式細(xì)胞儀鑒定EPC。 結(jié)果：(1)形態(tài)學(xué)觀察：密度梯度離心法分離出PBMNC，接種后均勻平鋪在培養(yǎng)皿底，加

8、入細(xì)胞因子rh-VEGF和rh-B-FGF培養(yǎng)24小時(shí)后開(kāi)始貼壁樣生長(zhǎng)，三天后可見(jiàn)成集落樣生長(zhǎng)，第四天可見(jiàn)細(xì)胞集落增大，貼壁較牢。第七天部分呈梭形改變。2-3周后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形改變，排列呈線狀。(2)細(xì)胞染色與鑒定：熒光顯微鏡和LSCM觀察發(fā)現(xiàn)95％以上細(xì)胞攝取1，1’-二(十八烷基)-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸(DiI)乙?；兔芏戎鞍?Acetylated LowDensity Lipoprotein，Ac-LD

9、L)(DiI-Ac-LDL)并結(jié)合FITC標(biāo)記荊豆凝集素(Ulexeuropaeus agglutinin，UEA)I(FITC-UEA-I)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD133陽(yáng)性率83.5％±5.3％：VEGF-R2陽(yáng)性率83.2％±8.2％；CD34陽(yáng)性率86.2％±6.2％。 結(jié)論：用密度梯度離心法分離的人PBMCs經(jīng)rh-VEGF、rh-B-FGF的M199培養(yǎng)，可以分化為CD133、VEGF-R2、CD34表達(dá)陽(yáng)性的早期E

10、PC。 第二部分軟脂酸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡及分泌炎性細(xì)胞因子影響 目的：探討軟脂酸對(duì)EPC凋亡、caspase-3蛋白及細(xì)胞因子TNF-α、IL-6分泌的影響。 方法：按第一部分方法培養(yǎng)EPC。細(xì)胞同步化處理，第8天分為5×2組，分別加入不同濃度的軟脂酸(palmitic acid，PA)及亞油酸(linoleic acid，LA)(0、100、200、400、800μmol/L)孵育48小時(shí)和濃度為400μmol/

11、L的PA孵育0、12、24、36、48、60小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例； Western-blot技術(shù)和酶標(biāo)法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)和活性；ELISA法測(cè)定收集的上清液中TNF-α、IL-6的濃度。 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比，200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L PA孵育組EPC的凋亡率明顯上升(P＜0.05)，400μg/L時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.001)；而LA各孵育組對(duì)EPC的凋亡率無(wú)影

12、響。(2)PA各孵育組均上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)、活性及TNF-α的分泌，而對(duì)IL-6的分泌無(wú)影響。400μmol/L PA孵育EPC隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率及caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，至48小時(shí)達(dá)峰值(P＜0.05)。 結(jié)論：PA呈濃度梯度和時(shí)間依賴性促EPC的凋亡并上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)和活性及細(xì)胞因子TNF-α的分泌，這可能是FFA促進(jìn)糖尿病發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。 第三部分軟脂酸促

13、內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究 目的：探討PA促進(jìn)EPC凋亡的MAPK通路機(jī)制。 方法：按第一部分方法培養(yǎng)EPC。細(xì)胞同步化處理后，第8天分別加上絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)三種酶p38 MAPK、Jnk、Erk的抑制劑干預(yù)EPC1小時(shí)后，再加入400μmol/L PA孵育EPC47小時(shí)，收集細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)，

14、分光光度法檢測(cè)caspase-3的活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Western-blot檢測(cè)MAPK細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Jnk、p38 MAPK的表達(dá)及磷酸化Jnk、磷酸化p38 MAPK的表達(dá)。ELISA法測(cè)定收集上述細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α的濃度，熒光顯微鏡測(cè)定上述細(xì)胞活性氧水平。 結(jié)果：(1)p38 MAPK抑制劑SB203580，Jnk-MAPK抑制劑SP600125抑制由PA刺激引起的EPC的凋亡及caspase-3

15、的蛋白表達(dá)、活性、TNF-α及活性氧的分泌，Erk-MAPK抑制劑PD10069則無(wú)此作用。(1)PA刺激磷酸化p38、Jnk-MAPK表達(dá)，p38 MAPK抑制劑SB203580，Jnk-MAPK抑制劑SP600125抑制PA刺激引起的磷酸化p38、Jnk-MAPK表達(dá)。 結(jié)論：磷酸化p38、Jnk-MAPK信號(hào)途徑的激活與PA促EPC凋亡、TNF-α及活性氧分泌的增加有關(guān)，予以P38、Jnk抑制劑可以減輕PA的促凋亡作用。

16、 第四部分通心絡(luò)對(duì)軟脂酸促EPC凋亡的干預(yù)作用及其機(jī)制研究 目的：觀察通心絡(luò)對(duì)PA誘導(dǎo)的EPC凋亡的干預(yù)作用，以及對(duì)MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子TNF-α分泌及活性氧表達(dá)的影響。 方法：按第一部分方法培養(yǎng)EPC。細(xì)胞同步化處理后，第8天分為5組：1．空白對(duì)照組：2.400μmol/L PA組；3.100μl/ml TXL+400μmol/L PA組；4.200μl/mlTXL++400μmol/LPA組；5.400μ

17、mol TXL++400μmol/L PA組。各組加通心絡(luò)干預(yù)1小時(shí)后，再加入400μmol/L PA孵育EPC47小時(shí)，收集細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)，分光光度法檢測(cè)caspase-3的活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Western-blot檢測(cè)MAPK)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Jnk、p38 MAPK的表達(dá)及磷酸化Jnk、磷酸化p38 MAPK的表達(dá)。ELISA法測(cè)定收集的上清液中TNF-α的濃度，共聚

18、集熒光顯微鏡觀察活性氧的水平。 結(jié)果：200μg/ml及400μg/ml TXL可抑制PA促EPC凋亡的作用及caspase-3的蛋白表達(dá)、活性、p-p38的表達(dá)和TNF-α分泌；各濃度組TXL均可抑制PA促EPC活性氧的表達(dá)。 結(jié)論：TXL通過(guò)下調(diào)磷酸化p38MAPK通路而抑制PA對(duì)EPC細(xì)胞的促凋亡作用并可以下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)和活性、細(xì)胞因子TNF-α的分泌及活性氧的表達(dá)。這可能是通心絡(luò)緩解糖尿病促進(jìn)動(dòng)