豬脾樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)豬細(xì)小病毒樣顆粒的體外內(nèi)吞研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒樣顆粒(Recombinant Parvovirus-like Particles，PPV-VLPs)保留了天然病毒的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，且能夠?qū)⑼庠葱拓i瘟病毒E290基因片段插入形成嵌合型豬細(xì)小病毒樣顆粒(PPV-VLPs-E290)，但PPV-VLPs-E290作為外源性抗原，被提呈進(jìn)入MHCⅠ類(lèi)分子途徑，并激活CTL反應(yīng)的機(jī)制目前尚不明確。為了探明該機(jī)制，本研究在已經(jīng)成功構(gòu)建了豬細(xì)小病毒樣顆粒(PPV-VL

2、Ps-E290)的基礎(chǔ)上，將動(dòng)物體內(nèi)抗原提呈功能最強(qiáng)、也是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為抗原提呈細(xì)胞，對(duì)PPV-VLPs-E290在DC細(xì)胞中的定位、捕獲以及提呈情況進(jìn)行了研究。
　　為了探明豬細(xì)小病毒樣顆粒(PPV-VLPs-E290)在樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)中的定位情況，本研究首先通過(guò)磁性篩選的方法從豬的脾臟分離CD172a+ CD11R+ DC，將PPV-VLPs-E290用熒光素FITC標(biāo)記后，體外與DC在3

3、7℃下作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在體外DC對(duì)PPV-VLPs的捕獲情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC陽(yáng)性細(xì)胞的比例為72％左右，表明DC在體外能有效捕獲PPV-VLPs-E290。捕獲PPV-VLPs-E290的DC用皂苷透化后，分別與內(nèi)吞體的表面標(biāo)志分子Rab5、Rab7、Rab11、Lamp2單克隆抗體及PE標(biāo)記的PPV-VP2抗體反應(yīng)，通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)PPV-VLPs-E290在DC中的定位情況。結(jié)果顯示，PPV-VLPs可與晚期內(nèi)吞體相

4、關(guān)蛋白分子Lamp2及Rab7的單抗共定位，而與Rab5、Rab11不共定位，表明PPV-VLPs被DC捕獲后，定位于DC的晚期內(nèi)吞體。
　　為了探明豬脾樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)捕獲豬細(xì)小病毒樣顆粒的方式，DC首先經(jīng)低滲和鉀離子缺乏處理先與抑制DC細(xì)胞不同提呈途徑的藥物如氯丙嗪、二甲基氨基吡咪、松胞素D、菲律平等分別在37℃下作用1h后，再與熒光素FITC標(biāo)記的豬細(xì)小病毒樣顆粒(FITC-PPV-VLPs-E290)在37℃下作用4h，

5、應(yīng)用流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡檢測(cè)在體外DC對(duì)PPV-VLPs的捕獲情況。結(jié)果顯示，鉀離子缺乏及氯丙嗪對(duì)DC的捕獲效率無(wú)影響，而經(jīng)二甲基氨基吡咪、菲律平及松胞素D處理的DC對(duì)PPV-VLPs-E290捕獲效率明顯下降。表明DC對(duì)PPV-VLPs-E290的捕獲與肌動(dòng)蛋白、巨胞飲及小窩蛋白介導(dǎo)的方式有關(guān)，而與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式無(wú)關(guān)。
　　為了進(jìn)一步對(duì)DC捕獲FITC-PPV-VLPs-E290的方式進(jìn)行鑒定，本研究又將DC與DC捕獲抗

6、原各個(gè)不同途徑中的關(guān)鍵因素抗體如:肌動(dòng)蛋白抗體，小窩蛋白caveolin-1抗體、豬IgG受體FcγRI(CD64)的抗體及DEC205抗體分別在37℃下作用1h后，再與FITC-PPV-VLPs-E290在37℃下作用1h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡檢測(cè)體外DC對(duì)FITC-PPV-VLPs-E290的捕獲情況。結(jié)果顯示，經(jīng)肌動(dòng)蛋白抗體處理的DC幾乎不能捕獲FITC-PPV-VLPs-E290，經(jīng)caveolin-1的抗體處理的DC對(duì)

7、PPV-VLPs-E29的捕獲效率明顯下降。而CD64及DEC205抗體則對(duì)DC的捕獲效率無(wú)影響，進(jìn)一步表明DC對(duì)PPV-VLPs-E290的捕獲依賴(lài)于肌動(dòng)蛋白，與巨胞飲、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式有關(guān)，而與吞噬作用及DEC205依賴(lài)的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式無(wú)關(guān)。
　　為了檢測(cè)PPV-VLPs-E290在DC中被DC攝取后的提呈情況。本研究通過(guò)磁性篩選的方法從豬瘟疫苗免疫豬的脾臟分離CD4-CD8+T細(xì)胞。DC先分別與伯氨喹、放線菌酮、氯

8、喹、乳胞素、布雷菲德菌素A及亮抑肽酶、胃酶抑素作用，再與PPV-VLPs-E290在37℃作用4h，然后與CD4-CD8+T細(xì)胞共孵育，制備效應(yīng)細(xì)胞，利用細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPV-VLPs-E290在DC中的提呈情況。結(jié)果顯示，放線菌酮、氯喹、乳胞素、布雷菲德菌素A(BFA)可強(qiáng)烈抑制DC對(duì)PPV-VLPs-E290提呈，胃酶抑素部分抑制，而經(jīng)伯氨喹、亮抑肽酶處理的DC對(duì)PPV-VLPs-E290的提呈則不受影響。這些結(jié)果表明，DC對(duì)