siRNA抑制PPARγ的表達(dá)對絨癌細(xì)胞JEG-3侵襲力的影響.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(PPARγ)屬Ⅱ型核受體超家族成員,其功能較復(fù)雜,參與糖及脂肪代謝、單核細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、增生和凋亡等生理病理過程。PPARγ在胎盤發(fā)育中是必需的,參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、增殖、遷移等過程,因而與生理及病理妊娠有著密切的聯(lián)系。近年來許多研究顯示子癇前期、胎兒生長受限及復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)生均與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力異常有關(guān)。本研究旨在利用小分子RNA干擾技術(shù)

2、抑制PPARγ在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中的表達(dá),研究其對體外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響,探討其參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的機(jī)制,為子癇前期、胎兒生長受限及復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3至對數(shù)生長期備用。
　　 2.根據(jù)Genebank中PPARγ的序列號,設(shè)計(jì)并化學(xué)合成PPARγ siRNA,為3條特異性的PPARγ siRNA,S1,

3、S2,S3;1條非特異性陰性對照siRNA,1條熒光標(biāo)記的非特異性陰性對照siRNA。
　　 3.常規(guī)培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞,種子六孔板中,將熒光標(biāo)記的空白對照siRNA以終濃度分別為100nmol/L,50nmol/L轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用熒光電子顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率,選擇轉(zhuǎn)染siRNA的最佳濃度。
　　 4.常規(guī)培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞,種于六孔板中,將實(shí)驗(yàn)①分為陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA),S1組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性siRN

4、A中的S1鏈),S2組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性siRNA中的S2鏈),S3組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性siRNA中的S3鏈),S4組(轉(zhuǎn)染混勻的PPARγ特異性siRNA中的S1、S2、S3鏈),進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　 5.采用實(shí)時定量PCR技術(shù)分別檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PPARγ mRNA的水平,選擇對PPARγ抑制效率最高的組。
　　 6.常規(guī)培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞至對數(shù)生長期,種于六孔板中,將實(shí)驗(yàn)②分為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性si

5、RNAS2鏈),陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA),空白對照組(不轉(zhuǎn)染任何siRNA,余試劑與其他兩組相同),進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　 7.采用實(shí)時定量PCR技術(shù)分別檢測三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PPARγ mRNA的水平,以檢測siRNA對PPARγ的抑制率,并測定黏蛋白MUC1 mRNA的水平。
　　 8.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將三組轉(zhuǎn)染24小時后的細(xì)胞,用含10％胎牛血清(fetal cow serum,FCS)的培養(yǎng)液重

6、懸,接種于包被matrigel基質(zhì)膠的小室上室,下室加入含20％FCS的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24小時后,常規(guī)HE染色,40倍顯微鏡下取5個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),用于檢測轉(zhuǎn)染PPARγ siRNA后JEG-3細(xì)胞的侵襲力。
　　 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示定量資料數(shù)據(jù),組間比較采用單因素方差分析,認(rèn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.熒光電子

7、顯微鏡下觀察以終濃度為100nmol/L熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率最高。
　　 2.轉(zhuǎn)染24小時后,與陰性對照組相比,S1組PPARγ mRNA水平下調(diào)了(40.88±1.05)％;S2組PPARγ mRNA水平下調(diào)了(71.92±0.71)％;S3組PPARγ mRNA水平下調(diào)了(62.69±0.66)％;S4組PPARγ mRNA水平下調(diào)了(52.8±0.52)％。得出S2組PPARγ siRNA的抑制效率最高。
　

8、　 3.轉(zhuǎn)染24小時后,與空白對照組相比,實(shí)驗(yàn)組PPARγ mRNA的表達(dá)水平下調(diào)了(75±0.8)％,陰性對照組PPARγ mRNA的表達(dá)無差異。各組細(xì)胞中MUC1 mRNA的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)組與空白組相比下調(diào)了(65±1.3)％,陰性對照組與空白對照組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.與空白對照組相比,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染PPARγ siRNA后,JEG-3細(xì)胞穿透Metrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,陰性對照組與空白對