STAT3-siRNA表達(dá)載體對肝癌細(xì)胞pim-2基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本研究選擇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activators of transcription，STAT3）作為目的基因，構(gòu)建短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達(dá)載體，對肝癌細(xì)胞中的stat3基因進(jìn)行干涉，探討stat3基因的改變對下游pim-2基因表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.STAT3-siRNA表達(dá)載體的制備按一定原則設(shè)計(jì)并合成

2、針對stat3基因的siRNA表達(dá)盒（STAT3-SECs）。將純化好的siRNA表達(dá)盒與psiLentGeneTM載體建立連接體系后，取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞Ecoil DH5α中，挑選陽性重組克隆，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切消化測序鑒定，確認(rèn)為實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)選取人源SMMC-7721肝癌細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞參照轉(zhuǎn)染試劑的操作說明，將STAT3-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人肝

3、癌細(xì)胞。
　　 4.觀察細(xì)胞形態(tài)變化轉(zhuǎn)染后24小時(shí)于倒置光顯微鏡下觀察細(xì)胞表象變化。
　　 5.RT-PCR TRIZOL提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板PCR合成pim-2基因片斷。以β-actin為內(nèi)參，凝膠圖像分析軟件分析，對比pim-2基因表達(dá)水平。
　　 6.Western Blot將提取的肝癌細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫結(jié)合及顯影，測定細(xì)胞中PIM-2蛋白的

4、表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，凝膠圖像分析軟件分析，對比PIM-2蛋白表達(dá)水平。
　　 7.應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和方差分析來分析比較各組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，α=0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.克隆
　　 1.1 siRNA表達(dá)盒測序結(jié)果經(jīng)Blast比對證實(shí)siRNA所含結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列相符。
　　 1.2 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定為實(shí)驗(yàn)所需表達(dá)載體。
　　 2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

5、　　 倒置顯微鏡下，SMMC-7721對照組細(xì)胞數(shù)目均增多、貼壁狀況良好、細(xì)胞多呈梭形或多角形、大小適中鋪滿整個(gè)視野，核仁清晰、可見核分裂相，SMMC-7721空轉(zhuǎn)染試劑組、SMMC-7721空質(zhì)粒組、SMMC-7721錯(cuò)配鏈-SECs表達(dá)載體組與SMMC-7721對照組相比基本無明顯變化。而SMMC-7721 STAT3-SECs表達(dá)載體組與SMMC-7721對照組相比細(xì)胞數(shù)目減少、貼壁狀況不好，形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂且有較多漂浮細(xì)胞

6、，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮及空泡、核質(zhì)比率倒置、核分裂相減少，細(xì)胞密度下降，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)折光性較強(qiáng)的圓形小泡樣結(jié)構(gòu)和細(xì)胞出芽樣改變，細(xì)胞間失去正常接觸抑制，細(xì)胞碎片增加、背景顆粒增多。隨著STAT3-SECs表達(dá)載體濃度的不斷加大，相應(yīng)的細(xì)胞變化程度也隨之加大。
　　 3.RT-PCR
　　 相對于SMMC-7721對照組，SMMC-7721空轉(zhuǎn)染試劑組、SMMC-7721空質(zhì)粒組、SMMC-7

7、721錯(cuò)配鏈-SECs表達(dá)載體組pim-2基因的相對表達(dá)量基本無明顯變化；SMMC-7721 STAT3-SECs表達(dá)載體組相對于SMMC-7721對照組pim-2基因的表達(dá)下調(diào)。
　　 4.Western Blot
　　 相對于SMMC-7721對照組，SMMC-7721空轉(zhuǎn)染試劑組、SMMC-7721空質(zhì)粒組、SMMC-7721錯(cuò)配鏈-SECs表達(dá)載體組PIM-2蛋白的相對表達(dá)量基本無明顯變化；SMMC-7721 S