慢病毒介導的uPAshRNA抑制絨癌細胞侵襲能力及機制的研究.pdf

1、目的:通過慢病毒載體介導的RNA干擾技術沉默人絨毛膜癌高侵襲力細胞株JEG-3中uPA基因的表達，觀察uPA的表達抑制后VEGF-B、MMP-2基因的表達變化及對JEG-3細胞侵襲能力的抑制作用，揭示uPA、VEGF-B、MMP-2在絨癌細胞侵襲轉移的作用機制及其關系，為后續(xù)的以uPA基因為靶點的絨癌基因治療研究奠定基礎。
　　 方法:(1)構建靶向人uPA基因的shRNA慢病毒載體(即pLKD-uPA-shRNA)并行PCR鑒

2、定、測序分析，包裝病毒后測定病毒滴度。
　　 (2)分別以僅添加等量培養(yǎng)液（空白對照組）、空載慢病毒（陰性對照組）、pLKD-uPA-shRNA（干擾組）感染絨毛膜癌高侵襲力細胞株JEG-3細胞。
　　 (3)應用實時定量PCR（quantitative Real-Time PCR）檢測感染前后uPA、VEGF-B、MMP-2 mRNA表達量的變化。
　　 (4)Transwell體外侵襲試驗檢測感染前后細胞侵襲

3、能力的變化。
　　 結果:(1)經(jīng)陽性克隆PCR鑒定及測序分析顯示能表達uPA shRNA的慢病毒載體構建正確。
　　 (2)包裝慢病毒后，滴度檢測為7.36×106Tu/ml。
　　 (3) qRT-PCR檢測顯示:空白對照組、陰性對照組、干擾組中uPA mRNA相對表達量分別為1.025±0.267、0.800±0.099、0.066±0.021，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，干

4、擾組與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (4)qRT-PCR檢測顯示:空白對照組、陰性對照組、干擾組中VEGF-B mRNA相對表達量分別為1.061±0.410、0.789±0.223、0.061±0.036，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，干擾組與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (5) qRT-PCR檢測顯示:空白對

5、照組、陰性對照組、干擾組中MMP-2mRNA相對表達量分別為1.009±0.161、0.717±0.222、0.071±0.021，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，干擾組與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (6) Transwell體外侵襲實驗檢測顯示:空白對照組、陰性對照組、干擾組JEG-3細胞穿膜數(shù)分別為200.00±11.13、205.00±14.52、61.

6、33±2.08，干擾組穿膜細胞數(shù)顯著減少，與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 (1)慢病毒介導的uPA shRNA可以有效感染JEG-3細胞并顯著沉默uPA基因的表達，是一種有效的基因沉默方法之一。
　　 (2)通過沉默uPA基因的表達，可以顯著抑制絨癌高侵襲力細胞株JEG-3的侵襲能力，表明uPA在絨癌