馬尾松花粉多糖硫酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)理.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室體內(nèi)研究曾表明，馬尾松花粉多糖(PPM60)及其硫酸酯化衍生物(SPPM60)均能通過增強(qiáng)免疫抑制小鼠體內(nèi)S180肉瘤，且SPPM60作用更強(qiáng)。本次實(shí)驗(yàn)擬從體外的角度，考察SPPM60或PPM60對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2生長(zhǎng)狀態(tài)的影響并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探討，明確硫酸酯化對(duì)松花粉多糖體外抑制腫瘤作用的影響，以期為馬尾松花粉多糖的開發(fā)利用提供理論支持，并為肝癌的防治提供一種潛在的方法。實(shí)驗(yàn)主要分為以下幾個(gè)部分。 一、PPM6

2、0的硫酸酯化：采用氯磺酸．毗啶法對(duì)2g PPM60進(jìn)行硫酸酯化改性，得到暗黃色產(chǎn)物3.72g。用氯化鋇一明膠比濁法鑒定其硫酸根含量并計(jì)算取代度為1.41。紅外光譜顯示已具有硫酸酯鍵(C—O—S和S=O)的特征吸收峰，表明多糖已被硫酸酯化。 二、SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力和形態(tài)的影響：MTT法檢測(cè)不同濃度SPPM60或PPM60作用不同時(shí)間對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2活力的影響。SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，

3、一定程度上具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。在200μg/mL濃度下作用72h SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)42.05％。而PPM60對(duì)HepG2細(xì)胞沒有抑制，甚至在某些條件下有輕微的促進(jìn)增殖作用。倒置顯微鏡觀察、HE染色、H0.33342/PI熒光雙染以及透射電鏡觀察SPPM60或PPM60對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)的影響。經(jīng)200μg/mL SPPM60處理72h后，細(xì)胞增殖速度顯著減慢，分布較稀疏，部分區(qū)域出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象

4、，細(xì)胞間距加大，貼壁能力減弱，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體形或樹枝狀，細(xì)胞器增多、發(fā)育完善，細(xì)胞核質(zhì)比例減小，核仁體積減小、數(shù)量減少，核內(nèi)異染色質(zhì)比例增加。PPM60組細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)和對(duì)照組沒有明顯差別。 三、SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響：流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SPPM60或PPM60處理前后HepG2細(xì)胞周期分布的變化。SPPM60組較對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例顯著性增加，S期和G2/M期細(xì)

5、胞比例均顯著性減少，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。PPM60組細(xì)胞周期變化很小。以Fura—2/AM為探針，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)SPPM60或PPM60處理前后[Ca2+]i的變化。SPPM60作用40min內(nèi)[Ca2+]i沒有明顯變化，作用24h、48h、72h后，SPPM60組[Ca2+]i與對(duì)照組相比均顯著性降低。PPM60組[Ca2+]i與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均沒有顯著性差異。 四、SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞代謝與分泌功能的影響：

6、分別用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)甲胎蛋白的表達(dá)，溴甲酚綠法測(cè)定白蛋白分泌、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量、重氮反應(yīng)比色法測(cè)定γ—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力、比色法測(cè)定堿性磷酸酶活力。SPPM60組細(xì)胞甲胎蛋白表達(dá)和γ—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力明顯降低，堿性磷酸酶活力及胎盤型堿性磷酸酶所占的比例均明顯降低，白蛋白分泌量明顯上升。PPM60組細(xì)胞沒有明顯變化。 以上結(jié)果表明：(1)PPM60對(duì)HepG2細(xì)胞沒有抑制作用，硫酸酯化以后產(chǎn)生了抑制作用。(2)SPP