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![PEI-alginate納米粒轉(zhuǎn)染VEGFR-3 siRNA后抑制內(nèi)皮祖細胞淋巴管新生的作用.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/e1717efd-4dc9-42c3-8c11-efdbf5656b3c/e1717efd-4dc9-42c3-8c11-efdbf5656b3c1.gif)
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文檔簡介
1、[目的]研究轉(zhuǎn)運載體聚乙烯亞胺-藻酸鹽(PEI-alginate)納米粒轉(zhuǎn)染的VEGFR-3 siRNA靶向抑制人臍帶血內(nèi)皮祖細胞淋巴管新生的作用,探討以淋巴管內(nèi)皮祖細胞為靶點抑制腫瘤淋巴新生和淋巴轉(zhuǎn)移的可行性。
[方法]用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法從胎兒臍帶血中分離出單個核細胞,用流式細胞儀分析VEGFR-3+CD34+細胞和VEGFR-3+CD133+細胞在單個核細胞中所占的百分比。通過流式細胞儀分選出VEGFR-
2、3+細胞,然后通過免疫細胞化學染色的方法鑒定VEGFR-3+細胞表面CD34和CD133的分布及表達。用VEGF-C誘導細胞數(shù)目的擴增。用水化法制備PEI-alginate納米粒以及包封VEGFR-3 siRNA制成PEI-alginate/siRNA納米復合物,通過掃描電子顯微鏡及粒度分析儀檢測納米復合物的表面特征、粒徑及表面電荷。按照人VEGFR-3的基因序列合成3段不同的siRNA,根據(jù)氮磷比(N/P)的不同,制備不同的納米復合物
3、。通過凝膠電泳阻滯法檢測PEI-alginate納米粒包封VEGFR-3siRNA的效率。用PEI-alginate納米粒轉(zhuǎn)染帶有熒光標記的VEGFR-3 siRNA,檢測VEGFR-3 siRNA的轉(zhuǎn)染細胞的效率。MTT法檢測不同N/P比值的納米復合物對細胞的毒性。透射電子顯微鏡檢測用納米復合物處理細胞后,納米復合物在細胞內(nèi)的分布及降解。通過MTT法、增殖細胞核抗原染色方法、跨膜遷移實驗及Matrigel凝膠內(nèi)毛細淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成實驗
4、分別檢測經(jīng)PEI-alginate/siRNA納米復合物轉(zhuǎn)染后淋巴管內(nèi)皮祖細胞的活性、增殖細胞數(shù)目、遷移細胞數(shù)目以及毛細淋巴管樣結(jié)構(gòu)的長度和面積的變化。
[結(jié)果]經(jīng)流式細胞儀分析結(jié)果VEGFR-3+CD34+細胞占單個核細胞的0.7%,VEGFR-3+CD133+細胞占單個核細胞的0.49%。免疫細胞化學染色顯示在VEGFR-3+細胞的細胞膜上有CD34和CD133的表達。剛分離的單個核細胞成圓形或橢圓形,經(jīng)VEGF-C誘導3
5、天后,大部分細胞開始伸出偽足,細胞呈梭形或多邊形,誘導7天后,細胞成簇分布,細胞呈長梭形,細胞量增多,體積增大。水化法制備的PEI-alginate納米粒經(jīng)粒度分析儀及掃描電鏡檢測其粒徑及電荷均符合納米粒載體的基本條件。納米粒轉(zhuǎn)染效率約84%。隨著納米粒轉(zhuǎn)染載體中PEI量的增加,納米粒所攜帶的VEGFR-3 siRNA的量增多。當N/P增至8時,溶液中的VEGFR-3 siRNA幾乎完全與PEI-alginate納米粒結(jié)合形成PEI-a
6、lginate/siRNA納米復合物。用不同N/P比值的納米復合物轉(zhuǎn)染細胞后,細胞的活性逐漸降低,當N/P=16時,細胞活性與對照組相比具有統(tǒng)計學意義。綜合考慮N/P為16為合適比例,以此比例制備的納米復合物進行后續(xù)實驗。將制備的納米粒復合物轉(zhuǎn)染細胞,透射電鏡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染2h后,納米復合物主要結(jié)合在細胞膜表面或剛進入細胞質(zhì);轉(zhuǎn)染4h時,大部分的復合物已經(jīng)進入細胞質(zhì),小部分納米粒開始降解;轉(zhuǎn)染6h時,大部分納米復合物在細胞質(zhì)中降解為較小的
7、顆粒。根據(jù)目的基因合成的不同VEGFR-3 siRNA與PEI-alginate納米粒制備成納米復合物,然后用這些不同的納米粒復合物轉(zhuǎn)染LEPCs,RT-PCR結(jié)果顯示用第1段siRNA制備的納米復合物轉(zhuǎn)染LEPCs后VEGFR-3 mRNA的表達最低,所以選此納米復合物進行后續(xù)的實驗。用藻酸鹽修飾的PEI納米粒處理細胞,細胞活性明顯高于未經(jīng)修飾的PEI??缒みw移結(jié)果顯示納米粒經(jīng)siRNA干擾的細胞遷移能力減弱。增殖細胞核抗原染色結(jié)果發(fā)
8、現(xiàn)經(jīng)納米粒處理的細胞熒光強度減弱。Matrigel凝膠內(nèi)毛細淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成實驗顯示VEGF-C組毛細淋巴管樣結(jié)構(gòu)的長度及面積明顯高于對照組,而VEGFR-3 siRNA抑制后毛細淋巴管樣結(jié)構(gòu)長度和面積明顯小于VEGF-C組。
[結(jié)論]PEI-alginate納米粒作為VEGFR-3 siRNA的轉(zhuǎn)運載體,可將VEGFR-3siRNA高效的轉(zhuǎn)入LEPCs。經(jīng)PEI-alginate/siRNA納米復合物轉(zhuǎn)染的LEPCs活性和遷
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