大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌顆粒上Ⅲ型IP3受體的免疫電鏡定位分析.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病的發(fā)生主要是由于胰島β細(xì)胞分泌胰島素的絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的。當(dāng)胰島β細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性的物質(zhì)，如葡萄糖、胰高血糖素、乳糖、核糖等刺激后，分泌胰島素經(jīng)全身血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)郊∪?、肝臟和脂肪組織等靶組織和靶器官，與其相應(yīng)的胰島素受體結(jié)合后，使血糖降低的同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪及蛋白質(zhì)的合成。
　　既往研究已證明，胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌顆粒胞裂外排分泌胰島素是由胞內(nèi)Ca2+濃度的迅速升高而直接引起的。胞內(nèi)鈣庫的C

2、a2+釋放和胞膜上鈣通道的Ca2+內(nèi)流是胞內(nèi)Ca2+升高的主要來源。胰島β細(xì)胞中存在多種鈣庫[1]，如IP3（Inositol-1,4,5-triphosphate，三磷酸肌醇）敏感鈣庫、蘭諾定（ryanodine）敏感鈣庫、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAADP）敏感鈣庫及線粒體鈣庫等。在小鼠胰腺細(xì)胞上首次發(fā)現(xiàn)了IP3敏感鈣庫，后來經(jīng)研究證實(shí)，在神經(jīng)、心肌、骨骼肌等多種細(xì)胞中都存在。IP3R（IP3Receptor）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核

3、膜上的一種配體門控Ca2+釋放通道蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌顆粒上也存在IP3R[2]。分泌顆粒作為β細(xì)胞內(nèi)含鈣量最高的鈣庫，里面有大量的鈣離子沉積。顆粒膜與質(zhì)膜融合發(fā)生胞吐時(shí)，鈣離子可伴隨胰島素內(nèi)容物一起外排，從而保持質(zhì)膜內(nèi)外鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡。而此過程可能是通過激活分泌顆粒膜上IP3R實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于分泌顆粒是如何準(zhǔn)確的參與并調(diào)節(jié)胰島素分泌，從而控制機(jī)體生理活動(dòng)的過程，目前尚不清楚，相關(guān)研究報(bào)道也甚少，并且仍有人質(zhì)疑IP3

4、R是否確實(shí)存在于分泌顆粒上[3]。因此，本研究參考并改進(jìn)了Blondel[2]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用膠體金免疫電鏡的技術(shù)對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌顆粒的IP3R-Ⅲ型進(jìn)行定位分析，進(jìn)一步明確分泌顆粒上IP3R-Ⅲ型的存在，提示IP3-IP3RⅢ型可能參與了β細(xì)胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)，為科室的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究IP3R與胰島素分泌的關(guān)系作出鋪墊。
　　目的：
　　應(yīng)用膠體金免疫電鏡的技術(shù)對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌顆粒的IP3R-Ⅲ型進(jìn)行定位

5、分析，明確分泌顆粒上是否存在IP3R-Ⅲ型。為進(jìn)一步揭示分泌顆粒的生理意義打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠經(jīng)胰腺膽總管逆行灌注Ⅴ型膠原酶溶液充分消化后，Histopaque-1077純化獲得充盈的胰腺。
　　2.雙硫腙溶液鑒定胰島。
　　3.胰島標(biāo)本經(jīng)固定后電鏡制樣。
　　4.免疫組織化學(xué)染色，一抗為兔抗大鼠IP3R-Ⅲ型抗體，二抗為5nm膠體金標(biāo)記的山羊抗兔IgG。對(duì)照組的一抗為TBS（pH7

6、.4），其他步驟相同。
　　5.經(jīng)過醋酸鈾、枸櫞酸鉛輕度復(fù)染后通過透射電子顯微鏡技術(shù)觀察5nm金顆粒在胰島β細(xì)胞的胰島素分泌顆粒上的分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.用雙硫腙染色后的胰島細(xì)胞團(tuán)，呈圓形或橢圓形，包膜完整，界限清楚，為不透光實(shí)體。雙硫腙染色后呈猩紅色。每個(gè)胰島直徑約為100～300μm。
　　2.實(shí)驗(yàn)組的胰島β細(xì)胞中，金顆粒大量定位于胰島素分泌顆粒的核心及顆粒膜上。并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也有少量的膠體金標(biāo)記。對(duì)