長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)：ABCB1遺傳多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異的影響.pdf

1、長(zhǎng)春地辛，是半合成的長(zhǎng)春堿衍生物，廣泛應(yīng)用于臨床惡性腫瘤包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。ABCB1是一種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與許多惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)。體外研究已表明長(zhǎng)春地辛是ABCB1的底物。ABCB1的基因多態(tài)性可以影響其表型，表遺傳因素也可能參與了ABCB1表達(dá)的調(diào)控。但是，目前沒(méi)有ABCB1基因多態(tài)性對(duì)長(zhǎng)春地辛體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)影響的報(bào)道，也沒(méi)有表遺傳因素對(duì)任何藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)影響的報(bào)道。同時(shí)，由于經(jīng)典的藥代動(dòng)力學(xué)研究需要進(jìn)行較密集的血

2、樣采集，很難在臨床上進(jìn)行，特別對(duì)于許多血液病患者，反復(fù)多次采血的依從性很差。因此，進(jìn)行了以下研究：(1)采用了群體藥代動(dòng)力學(xué)的方法，通過(guò)有限的采血點(diǎn)建立長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)模型，估算群體參數(shù)值，再結(jié)合Bayesian反饋法，較準(zhǔn)確地計(jì)算出個(gè)體參數(shù)。(2)比較3種ABCB1主要單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A、C1236T及由它們構(gòu)成的單倍體型在中國(guó)漢族健康人群和淋巴系統(tǒng)惡性疾病患者中的分布，觀察不同基因型之間啟動(dòng)子區(qū)域甲基

3、化程度的差異。(3)研究C3435T、G2677T/A、C1236T單核苷酸多態(tài)性和單倍體型對(duì)長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)的影響。(4)初步探討ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)的影響。 為了完成本實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用了以下研究方法： 1.建立長(zhǎng)春地辛靜脈推注的群體藥代動(dòng)力學(xué)模型 100名在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院住院治療的中國(guó)漢族血液惡性腫瘤患者參加了本試驗(yàn)。其中男性患者62名，女性患者38名?；颊呔鶈蝿┝拷o與長(zhǎng)春

4、地辛3mg快速靜脈推注，推注結(jié)束后開(kāi)始計(jì)時(shí)，依據(jù)計(jì)算機(jī)預(yù)先生成的采血時(shí)間表在0、5min，20min，1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)10個(gè)采血點(diǎn)中隨機(jī)采取2-3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜脈血樣。HPLC-MS/MS法檢測(cè)血漿長(zhǎng)春地辛濃度。使用非線性混合效應(yīng)模型(NONMEM)進(jìn)行計(jì)算，Bayesian回歸法推算個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 2.ABCB1單核苷酸多態(tài)性基因型和單倍體型的測(cè)定 使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-

5、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)測(cè)定ABCB1的3個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T突變，應(yīng)用PHASE2.0重構(gòu)單倍體型。 3.ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分析 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性?xún)?nèi)切酶法(COBRA)進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分析。1-2μgDNA稀釋至50μl，變性后亞硫酸氫鈉硫化處理，使DNA中未甲基化的C轉(zhuǎn)化為T(mén)，PCR擴(kuò)增，限制性?xún)?nèi)切酶酶切后非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，EB

6、染色后進(jìn)行灰度掃描。 4.統(tǒng)計(jì)方法 所有統(tǒng)計(jì)均使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。不同基因型組間基因型分布頻率差異采用卡方檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。不同基因型之間的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度差異使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。由于不能完全滿足雙正態(tài)分布，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的相關(guān)分析使用Speramen法。P<0.05被認(rèn)為有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，本課題的主要研究結(jié)果如下： 1.建立了長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)模型，表觀清除率(CL/F)、半衰期(T1/2)、表觀分布容積(V)和曲線下面積(AUC)等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的均值分別為0.381±0.108L/h，22.8±10.4h，170.12±69.29L，149±67μg/L.h-1。除CL/F較報(bào)道稍高外，其余藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本與I期臨床研究報(bào)道一致。 2.在中國(guó)漢族惡性淋巴系統(tǒng)腫瘤患者中，

8、ABCB1的C3435T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為34％，突變型純合子TT的頻率為22％，突變型雜合子CT的頻率為44％；ABCB1的C1236T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為10％，突變型純合子TT的頻率為48％，突變型雜合子CT的頻率為43％；ABCB1的G2677T/A單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子GG的頻率為18％，突變型純合子中TT的頻率為16％，TA的頻率為9％，AA的頻率為2％，突變型雜合子GT的頻率

9、為42％，GA的頻率為13％。在單倍體型分析中，12中可能的單倍體構(gòu)型組合中共有9種單倍體型被重構(gòu)，其中TTT、FGC、CGC和CAC占整個(gè)中國(guó)漢族人群的90％以上。與健康人比較，淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤患者的基因頻率和單倍體型頻率沒(méi)有顯著性差異。 3.健康志愿者和患者間甲基化程度存在顯著性差異。發(fā)現(xiàn)C3435T和G2677T/A不同基因型受試者中啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度具有顯著性差異，C1236T不同基因型之間啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度沒(méi)有顯著

10、性差異。 4.在ABCB1基因型對(duì)長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)的影響研究中，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春地辛藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)CL/F個(gè)體間存在3.5倍的差異，但是ABCB1的3個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和單倍體型之間的長(zhǎng)春地辛藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5.在ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度對(duì)長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)的影響研究中，發(fā)現(xiàn)ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與CL/F成正相關(guān)(rs=0.3

11、65)，與AUCrs=-0.366)、Vd(rs=-0.339)存在負(fù)相關(guān)。而與T1/2不存在相關(guān)性。 從本試驗(yàn)中可以得出以下結(jié)論： 1.中國(guó)漢族血液惡性腫瘤患者中長(zhǎng)春地辛的藥代動(dòng)力學(xué)符合3室模型和一級(jí)動(dòng)力學(xué)消除。本長(zhǎng)春地辛群體藥代動(dòng)力學(xué)模型可用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究和血藥濃度監(jiān)測(cè)，特別是當(dāng)采樣受到限制，不能使用經(jīng)典的藥代動(dòng)力學(xué)方法時(shí)。 2.ABCB1 3個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C12

12、36T各基因型和單倍體型與淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病無(wú)關(guān)。中國(guó)漢族健康志愿者中ABCB1 3個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和單倍體型頻率與淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤患者的基因頻率和單倍體型頻率相似。ABCB1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與C3435T和G2677T/A基因型存在相關(guān)性，但是其機(jī)制和臨床意義還需要進(jìn)一步探討。 3.ABCB1 3個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A、C1236