人參皂甙Rg3不同構(gòu)型免疫佐劑作用和抗氧化作用及其機(jī)理的研究.pdf

1、人參皂苷Rg3(ginsenoside-Rg3)屬于原人參二醇型皂苷，是一種從人參(Panaxginseng C.A.Meyer)中分離提取出來的天然化合物。由于其對腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，所以在人醫(yī)臨床被廣泛用于治療各種腫瘤疾病。Rg3在自然界中存在20-C鍵的兩種差向異構(gòu)體，即20(R)-Rg3和20(S)-Rg3，近年來研究表明兩種Rg3異構(gòu)體在許多免疫活性研究中存在顯著差異。因此，本論文通過研究Rg3兩種異構(gòu)體的免疫佐劑作用、

2、抗氧化作用和對巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，研究Rg3兩種異構(gòu)體的免疫學(xué)特性，并比較兩者間免疫活性的差異。
　　 1 Rg3不同構(gòu)型免疫佐劑作用的研究
　　 目的：采用OVA作為模式抗原，探討Rg3兩種不同構(gòu)型的免疫佐劑作用和對小鼠Th1/Th2免疫平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：將32只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別為生理鹽水對照組、OVA對照組、OVA+20(R)-Rg3佐劑組和OVA+20(S)-Rg3佐劑組。第一次免疫后，間

3、隔3周再免疫第二次。分別采集一免和二免后第14天小鼠血液，并檢測血清IgM抗體水平、IgG及其亞類抗體水平。二免后第14天，所有供試小鼠處死并分離培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞，RT-PCR法檢測OVA抗原刺激后脾淋巴細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)；采用MTT法測脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)；Western-blot法檢測血清中細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果：20(R)-Rg3或20(S)-Rg3做為免疫佐劑與OVA對照組相比，均能顯著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特異性

4、IgG及其亞類(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)和IgM水平；促進(jìn)小鼠脾淋巴體外增殖(P<0.05)；顯著增強(qiáng)細(xì)胞因子Interleukin-4(IL-4)，Interleukin-10(IL-10)，Interferon-γ(IFN-γ)，Interleukin-12(IL-12)以及核轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3的表達(dá)(P<0.05)；顯著增強(qiáng)血清中細(xì)胞因子Interleukin-5(IL-5)和Interferon

5、-γ(IFN-γ)的表達(dá)(P<0.05)。且OVA+20(R)-Rg3組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于OVA+20(S)-Rg3組。結(jié)果表明，20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均具有明顯的免疫佐劑效應(yīng)，并且能調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2免疫平衡，20(R)-Rg3免疫佐劑效果優(yōu)于其異構(gòu)體20(S)-Rg3。
　　 2 Rg3不同構(gòu)型抗氧化作用的研究
　　 目的：用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide Cy)建立小鼠免疫抑制模型，在此

6、基礎(chǔ)上應(yīng)用20(R)-Rg3和20(S)-Rg3處理小鼠，觀察20(R)-Rg3和20(S)-Rg3對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase ACP)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase SOD)、一氧化氮(Nitric Oxide NO)、溶菌酶(Lysozyme LZM)、總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity T-AOC)、黃嘌呤氧化酶(Xant

7、hine Oxidase XOD)、過氧化氫酶(Catalase CAT)和丙二醛(Malondialdehyde MDA)等免疫學(xué)和抗氧化指標(biāo)的影響，探討20(R)-Rg3和20(S)-Rg3對小鼠抗氧化能力的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：20(R)-Rg3或20(S)-Rg3均可提高由Cy誘導(dǎo)的免疫抑制導(dǎo)致降低的小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、ACP活性、SOD活性、LZM活性、T-AOC和CAT活性；降低Cy誘導(dǎo)的NO、XOD活性和MDA水平的升高。結(jié)

8、果表明，20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均能對抗Cy誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制，具有明顯的抗氧化作用，20(R)-Rg3抗氧化活性優(yōu)于其異構(gòu)體20(S)-Rg3。
　　 3 Rg3不同構(gòu)型對巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用的研究
　　 目的：體外分析20(R)-Rg3和20(S)-Rg3對巨噬細(xì)胞系RAW264.7呼吸爆發(fā)和吞噬活性的影響及誘導(dǎo)鼠源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子(IL-10和TNF-α)和Nuclear factor kappa

9、B(NF-κB)分泌的作用。方法：實(shí)驗(yàn)一經(jīng)20(R)-Rg3或20(S)-Rg3預(yù)培養(yǎng)的RAW264.7，用二氫諾丹明(Dihydrorhodamine123 DHR)處理后，與粉紅色熒光乳膠微球共同培養(yǎng)，由于細(xì)胞的呼吸爆發(fā)作用可引起細(xì)胞內(nèi)本身不發(fā)光的DHR轉(zhuǎn)化為發(fā)綠色熒光的諾丹明(Rhodamine ROD)，用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡同時測定粉紅色熒光(代表細(xì)胞吞噬或粘附粉紅色熒光微球的數(shù)量)和綠色熒光(間接反應(yīng)了細(xì)胞呼吸爆發(fā)的

10、力度)，以檢測20(R)-Rg3和20(S)-Rg3對巨噬細(xì)胞Raw264.7呼吸爆發(fā)和吞噬活性的影響。實(shí)驗(yàn)二以Raw-blue cells作為研究對象，分別加入不同濃度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/ml)以刺激細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三以不同濃度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/ml)刺激RAW264.7，并收集細(xì)胞，用RT-

11、PCR法檢測細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子Interleukin-10(IL-10)水平和Tumornecrosis factor-α(TNF-α)水平。結(jié)果：20(R)-Rg3能顯著提高RAW264.7的呼吸爆發(fā)作用和吞噬活性(P<0.05)，相反，20(S)-Rg3顯著抑制了正常RAW264.7的呼吸爆發(fā)作用和吞噬活性(P<0.05)；20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化隨濃度的不斷增大而降低，但不受LPS特異性抑制

12、劑PMB抑制，且20(R)-Rg3刺激細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化程度大于20(S)-Rg3(P<0.05)；體外20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激細(xì)胞內(nèi)TNF-a和IL-10的分泌隨濃度的不斷增大而降低。與20(S)-Rg3相比，20(R)-Rg3能顯著刺激細(xì)胞內(nèi)TNF-a和IL-10的分泌(P<0.05)。結(jié)果表明，20(R)-Rg3可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞呼吸爆發(fā)作用和吞噬作用清除機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用，但20(S)-R