Apoptin亞細胞定位機理研究.pdf

1、為研究Apoptin在腫瘤細胞和正常細胞中亞細胞定位的機理,首先考察了帶有增強型綠色熒光蛋白標簽的Apoptin在各種不同腫瘤細胞和正常細胞中的亞細胞定位.為研究Apoptin在腫瘤細胞中核定位的機制,通過生物信息學分析預測了Apoptin的核定位信號.在此基礎上構建了一系列核定位信號突變體,以EGFP作標簽,通過熒光觀察分析Apoptin及其突變體的亞細胞定位.通過生物信息學分析發(fā)現Apoptin還含有一個可能的核外運信號.為了確定A

2、poptin的pNES是否具有核外運功能,采用核外運特異性抑制劑leptomycin B(LMB)處理大鼠原代肝細胞.另外,實驗中還發(fā)現Apoptin的pNES決定了Apoptin在細胞中形成聚合體的能力.Apoptin的pNES缺失體在細胞中幾乎不能形成明顯的積聚體.而在大腸桿菌中表達的Apoptin的pNES缺失體其形成包涵體的能力也明顯降低,幾乎全部以可溶性的形式存在.與此對照的是,在大腸桿菌中表達的野生型Apoptin則主要以包

3、涵體的形式存在,并且其變性和復性均較困難.鑒于包涵體的形成常常與蛋白質的積聚傾向有密切的關系.上述結果說明Apoptin的pNES對于Apoptin積聚體的形成是有重要貢獻的.重組表達的pNES缺失體,不能形成雙體分子,而野生型Apoptin可以形成雙體,這進一步說明pNES對Apoptin聚合體的形成是必需的.此外,采用金屬離子螯合柱輔助復性技術解決了重組Apoptin復性難的問題.研究還發(fā)現在大腸桿菌中表達的Apoptin經體外復性

4、后以單體或二聚體的形式存在,并不形成多聚體,這與文獻報道的結果不同.文獻報道體外復性的Apoptin形成30~40亞單位組成的多聚體.總之,該研究發(fā)現了Apoptin的雙組分核定位信號,證明了該雙組分核定位信號不具有腫瘤細胞特異性,不受磷酸化作用調控.Apoptin的腫瘤細胞特異性核定位依賴于其pNES和NLS的同時存在.Apoptin的N端1-46氨基酸包含細胞質滯留信號.Apoptin在正常細胞中的細胞質定位是由于其胞質滯留作用和核