家蠶BmycaCR基因的原核表達和亞細胞定位研究.pdf

1、ycaCR蛋白含有一個保守的ycaC-related結(jié)構(gòu)域,屬于異分支酸酶超家族,據(jù)推測其功能可能與異分枝酸酶類似,但是具體底物和生物學功能尚不清楚。
　　 從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中檢索到一個EST序列,該序列編碼一個含有ycaC-related保守結(jié)構(gòu)域的蛋白的一個片斷,進而得到該cDNA的全長序列。該序列被命名為BmycaCR,GenBank登錄號為GU292794。預(yù)測該基因編碼的蛋白分子量為22.838 kD

2、。我們將其完整ORF序列克隆到原核表達載體pET-28a(+)中,構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定成功后,轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達了融合蛋白His-BmycaCR。超聲破碎后發(fā)現(xiàn)該蛋白以可溶的形式存在于上清中,經(jīng)親和層析純化后,得到較純的融合蛋白His-BmycaCR。將純化后的His-BmycaCR為抗原免疫新西蘭大白兔后制備該蛋白的多克隆抗體,經(jīng)ELISA檢測,抗體效價可達1:6400

3、以上。我們還采用熒光定量PCR和Western blot的方法,對BmycaCR在家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個發(fā)育時期以及五齡幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄水平和表達情況進行分析,結(jié)果顯示:在各發(fā)育時期中,BmycaCR基因在卵時期的轉(zhuǎn)錄水平和表達量最高,而在蛾時期的轉(zhuǎn)錄水平和表達量最低,在家蠶五齡幼蟲各組織中,BmycaCR基因的轉(zhuǎn)錄水平由高到低依次為睪丸、氣管、脂肪體、卵巢、表皮、腸、血、馬氏管、絲腺、頭部;在五齡幼蟲的各組織中,該蛋白在睪丸、