雞Piwi的亞細(xì)胞定位及其沉默效率的研究.pdf

1、Piwi基因主要存在于生殖細(xì)胞中，在生殖系干細(xì)胞的維持和精子發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。其編碼的蛋白屬于Argonaute基因家族，Argonaute家族因參與RNA干擾而為人們所熟知。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在小鼠、果蠅、人、恒河猴、豬、新桿狀線(xiàn)蟲(chóng)、鵪鶉等物種中對(duì)Piwi基因進(jìn)行了一系列的研究，而對(duì)雞Piwi基因的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)以雞為模式動(dòng)物，依據(jù)Piwi的cDNA序列，分別構(gòu)建了pEGFP-C1-Piwi和pcDNA3.1-Piwi兩種不

2、同的重組質(zhì)粒并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)定位PIWI蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。同時(shí)以雞原始生殖細(xì)胞(PGCs)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒?gòu)建Piwi-shRNAs，采用RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)染PGCs，運(yùn)用Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后PGCs中Piwi基因、生殖細(xì)胞形成和配子發(fā)生相關(guān)的調(diào)控因子(CVH、Dazl)以及調(diào)控干細(xì)胞多能性及自我更新的轉(zhuǎn)錄因子（Nanog、Sox2）的mRNA水平的相對(duì)表

3、達(dá)量。與此同時(shí)，將shRNA質(zhì)粒用于在活體-雞胚水平的干擾試驗(yàn)，即采用雞胚盤(pán)下腔注射技術(shù)將Piwi-shRNAs注射到44-48h胚齡的雞胚體內(nèi)，采集注射5，12，19日齡的雞胚性腺樣品，檢測(cè)Piwi，及CVH、Dazl、Nanog、Sox2這四種基因的mRNA水平的表達(dá)量。為探討禽類(lèi)Piwi基因的亞細(xì)胞定位及其在生殖干細(xì)胞和配子發(fā)生中的功能研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。結(jié)果表明:
　　1.通過(guò)構(gòu)建兩組重組載體的研究發(fā)現(xiàn):利用pEGFP-C(

4、1)-Piwi載體檢測(cè)到整個(gè)細(xì)胞都發(fā)光，而使用pcDNA3.1-Piwi載體僅在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到有表達(dá)，與在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，與pEGFP-C1-Piwi相比，pcDNA3.1-Piwi載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。表明免疫熒光技術(shù)更適合PIWI蛋白的定位研究。
　　2.細(xì)胞水平上的特異性shRNAs抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):24h后可檢測(cè)出明顯抑制，48 h達(dá)到高峰，72 h后開(kāi)始減弱。在3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差

5、異(P＞0.05)，且3組特異性shRNAs與陰性對(duì)照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)于3組特異性shRNAs進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)shRNA-2沉默效率最高，3組特異性shRNAs對(duì)雞Piwi基因的表達(dá)在不同時(shí)間均有不同程度的抑制作用，且抑制效果與shRNA序列相對(duì)于靶基因的位置和轉(zhuǎn)染時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。轉(zhuǎn)染48 h后的shRNA-2序列靶向抑制Piwi基因表達(dá)效率最高。
　　3.雞胚水平上的特異性shRNAs抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在三

6、個(gè)時(shí)間點(diǎn)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯的差異(P＞0.05)，3組特異性shRNAs與陰性對(duì)照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05)，在注射后第5天時(shí)，Piwi基因的相對(duì)表達(dá)量均較低，在第12天時(shí)，干涉質(zhì)粒shRNA-2的Piwi相對(duì)表達(dá)量最低。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行比較，出現(xiàn)明顯的抑制效果。在第19天時(shí)，抑制作用開(kāi)始減弱。表明不同時(shí)間點(diǎn)的3組特異性的shRNAs對(duì)雞Piwi表達(dá)產(chǎn)生不同程度的抑制作用，且轉(zhuǎn)染時(shí)間的長(zhǎng)短和shRNA序

7、列相對(duì)于靶基因的位置影響Piwi基因的抑制效果，shRNA-2序列的沉默效率最高，與細(xì)胞水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　4.Real-Time qPCR檢測(cè)PGCs細(xì)胞中CVH、Dazl及Nanog、Sox2的相對(duì)表達(dá)量顯示:與陰性對(duì)照組相比，抑制Piwi基因表達(dá)后，CVH、Dazl基因表達(dá)量上升，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。而Nanog基因表達(dá)也上升，但差異不顯著。而Sox2基因表達(dá)量下降且差異顯著(P＜0.05)。在雞胚盤(pán)下