CRM1調(diào)控Mps1亞細(xì)胞定位的機(jī)制研究.pdf

1、真核生物中，細(xì)胞通過有絲分裂將姐妹染色單體平均分配到子細(xì)胞中，使每個(gè)子細(xì)胞得到與母細(xì)胞完全相同的染色體，這對(duì)于維持生物體基因組的穩(wěn)定性具有重要的意義。為確保有絲分裂過程能夠準(zhǔn)確無誤的完成，細(xì)胞利用一系列的調(diào)控元件來對(duì)有絲分裂的關(guān)鍵步驟（包括有絲分裂進(jìn)入，后期啟動(dòng)，有絲分裂退出）進(jìn)行監(jiān)控。紡錘體組裝檢查點(diǎn)（Spindleassemblycheckpoint，SAC）是一個(gè)非常保守的有絲分裂調(diào)控機(jī)制，主要檢查紡錘體微管與染色體動(dòng)粒之間是否正

2、確連接，通過激活一系列蛋白的相互作用將細(xì)胞阻止在有絲分裂中期，直到所有的染色體都排列到有絲分裂赤道板上，并為紡錘體微管正確的捕獲，此時(shí)，檢查點(diǎn)信號(hào)消失，細(xì)胞從中期進(jìn)入后期。該檢查點(diǎn)的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　 Mps1是一個(gè)可以磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的雙特異性蛋白激酶，且具有自身磷酸化活性，是SAC的重要組成成分，通常位于SAC信號(hào)途徑的上游，對(duì)于檢查點(diǎn)的激活和維持是必需的。Mps1的亞細(xì)胞定位受到嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控:在

3、間期，Mps1主要分布在細(xì)胞質(zhì)，中心體和核孔上;當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期時(shí)，Mps1從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核且在前期，前中期出現(xiàn)明顯的動(dòng)粒定位，到中期后期Mps1在動(dòng)粒上的定位逐漸減少;當(dāng)細(xì)胞有絲分裂結(jié)束核膜重新形成后，Mps1又被重新運(yùn)出細(xì)胞核。
　　 細(xì)胞核內(nèi)的貨物蛋白要完成出核的過程通常需要另外一些蛋白的輔助，這些輔助蛋白包括:CRM1，RanGTP，Ran-GAP1等。CRM1是核轉(zhuǎn)運(yùn)受體importinβ家族的一員，它可以識(shí)別

4、亮氨酸富集的核輸出信號(hào)序列，將蛋白質(zhì)從細(xì)胞核運(yùn)出到細(xì)胞質(zhì)，另外，它也可以幫助許多RNA完成核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。LeptomycinB(LMB)是CRM1的特異性抑制劑，它可以直接和CRM1結(jié)合，從而抑制CRM1介導(dǎo)的蛋白出核。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的研究以及Mps1相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)，我們分析，Mps1作為細(xì)胞周期中的主要蛋白，很可能也受CRM1的調(diào)控，然而，關(guān)于CRM1調(diào)控Mps1進(jìn)而影響有絲分裂過程的機(jī)制，目前知之甚少。
　　 為驗(yàn)證Mps1是否

5、受CRM1的調(diào)控，本文首先通過GST-pulldown實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Mpsl與CRM1存在相互作用。因CRM1通常是與蛋白的核輸出信號(hào)序列(nuclearexportsignal，NES)結(jié)合，所以我們推測(cè)Mps1很可能存在出核序列。我們通過NetNES和ELM軟件分析Mps1的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)典型的核輸出信號(hào)序列pNES1，該序列具有通常的核輸出信號(hào)序列所具有的亮氨酸聚集區(qū)。將該序列與EGFP融合，能夠?qū)GFP靶向定位至細(xì)胞質(zhì)，加入

6、LMB則能重新誘導(dǎo)EGFP的入核。為了進(jìn)一步分析pNES1對(duì)于Mps1定位的影響，我們將Mps1中pNES1序列中的幾個(gè)氨基酸突變，出乎意料的是該突變并沒有引起Mps1的細(xì)胞核積累，LMB處理也不能誘導(dǎo)該突變的Mps1在間期入核，因此，我們推測(cè)可能pNES1對(duì)Mps1在間期的出入核均是需要的。我們進(jìn)一步以穩(wěn)定表達(dá)YFPMps1融合蛋白的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480YFPMps1為模型，通過免疫熒光和活細(xì)胞攝影實(shí)驗(yàn)觀察了LMB處理對(duì)YFPMps

7、1的亞細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)影響。研究發(fā)現(xiàn)，LMB處理能夠引起Mps1在細(xì)胞核內(nèi)的大量積累，且隨著LMB處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Mps1在細(xì)胞核內(nèi)的積累越多;進(jìn)一步觀察Mps1在動(dòng)粒上的定位，發(fā)現(xiàn)LMB處理能夠顯著增加Mps1在有絲分裂中期和后期動(dòng)粒上的定位;對(duì)HeLaS3H2BGFP細(xì)胞系的活細(xì)胞攝影實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LMB處理使細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程延長(zhǎng)了約20min。通過上述研究，我們初步揭示了間期CRM1對(duì)Mps1分子在中期動(dòng)粒上的解離是需要的，破壞兩者之間