SARS-CoV X2蛋白亞細(xì)胞定位及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、2002年底，在我國(guó)南方發(fā)現(xiàn)了一種新型的傳染性嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)，并波及眾多國(guó)家和地區(qū)，引起廣泛關(guān)注。隨后經(jīng)過(guò)各國(guó)研究者通力合作，很快確證了一種新的冠狀病毒為導(dǎo)致該疾病的病原體，并命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)。緊接著完成了SARS-CoV的基因組測(cè)序，并通過(guò)多種途徑分析了其基因組結(jié)構(gòu)特征。據(jù)預(yù)測(cè)，SARS-CoV的基因組有14個(gè)潛在的編碼蛋白

2、大于40個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，包括復(fù)制相關(guān)蛋白酶基因和四個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、N、E)基因，以及幾個(gè)與其它已知蛋白無(wú)明顯同源性的未知蛋白的編碼基因。未知蛋白X2由ORF4編碼，共154個(gè)氨基酸，與其它已知蛋白沒(méi)有明顯的同源性。本研究把X2基因插入綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1、pEGFP-C1和載體pCMV-myc，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293、COS-7和VERO細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞熒光和免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，X2蛋白定位于細(xì)

3、胞核，并且呈點(diǎn)狀聚集；進(jìn)一步與核仁蛋白C23共定位，發(fā)現(xiàn)X2蛋白定位于核仁，且在不同細(xì)胞中，X2蛋白的定位狀態(tài)表現(xiàn)一致。通過(guò)構(gòu)建一系列X2蛋白缺失突變體與EGFP融合表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行與C23的共定位，發(fā)現(xiàn)X2的核仁定位信號(hào)位于C端的134-154位氨基酸殘基，這與用生物信息學(xué)方法分析的結(jié)果一致。采用流式細(xì)胞儀分析，發(fā)現(xiàn)X2蛋白的表達(dá)能引起Vero、293和COS-7細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并且能夠誘導(dǎo)COS-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。