紅活麻總香豆素制備工藝及免疫抑制作用研究.pdf

1、目的:建立紅活麻香豆素的含量測定方法;篩選制備總香豆素有效部位的最佳工藝;通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)研究,探討紅活麻總香豆素的免疫抑制作用。
　　方法:(1)以濱蒿內(nèi)酯為對照品,采用紫外分光光度法(UV),于340nm波長處測定吸光度,對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率進(jìn)行考察,建立紅活麻總香豆素的含量測定方法。
　　(2)以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)因素為考察對象,每個(gè)因素分別設(shè)3個(gè)水平,進(jìn)行L9(34)正

2、交試驗(yàn),以總香豆素的提取率作為評價(jià)指標(biāo),優(yōu)選最佳醇提工藝;取3種備選樹脂,進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn),篩選出最佳樹脂;通過考察最佳樹脂對紅活麻總香豆素的吸附性能和洗脫參數(shù),主要包括:上樣濃度、徑高比、最大上樣量、水洗體積用量、洗脫液醇濃度以及洗脫劑用量,以篩選出最佳純化工藝。(3)體外培養(yǎng)BALB/c小鼠T、B淋巴細(xì)胞,四唑鹽比色法(MTT)檢測紅活麻總香豆素對其增殖反應(yīng)的影響;建立體內(nèi)卵清白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的BALB/c小鼠免疫功能增強(qiáng)模型,

3、將小鼠分為模型對照組,空白對照組,紅活麻總香豆素高、中、低劑量組,于免疫當(dāng)天開始給藥,每日給藥一次,連續(xù)4周。給藥結(jié)束后,處死小鼠,測定免疫器官/體重比值,觀察對脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響。BALB/c小鼠給藥4周,通過遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)以及溶血空斑形成數(shù)量,觀察紅活麻總香豆素對免疫系統(tǒng)的作用。
　　結(jié)果:(1)濱蒿內(nèi)酯對照品在0.004～0.012mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好,精密度RSD值為0.11％,穩(wěn)定性R

4、SD值為0.3％和0.41％,重復(fù)性RSD值為1.51％,平均回收率為99.38％,RSD值為1.8％。
　　(2)最佳提取工藝:紅活麻粗粉浸漬于70％乙醇中提取3次,每次1.5h,溶媒用量為4倍。最佳純化工藝:選用HPD300大孔吸附樹脂,以樹脂徑高比為1:7,上樣液濃度為0.4g生藥·mL-1上樣,藥材和樹脂的用量比為4:1。上樣之后,用4倍柱體積(BV)的蒸餾水除去雜質(zhì),再用4BV的70％乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫。收集70％乙

5、醇洗脫液,揮干溶劑即得紅活麻總香豆素有效部位。
　　(3)紅活麻總香豆素高、中、低濃度組對體外培養(yǎng)的T、B淋巴細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用,中濃度對T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用最為明顯,而低濃度對B淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用最好;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,給藥組小鼠免疫臟器指數(shù)與模型組相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高、中、低劑量均可以抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),與模型組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),中劑量的抑制作用強(qiáng)于高、低劑量;高、

6、中、低劑量均可以降低BALB/c小鼠DTH反應(yīng)的足跖腫脹度,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);抗體生成實(shí)驗(yàn)表明,高、中劑量組的溶血空斑數(shù)與對照組相比,均減少,且差異具有顯著性(P<0.01),而低劑量組與對照組相比,溶血空斑數(shù)雖有所減少,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:(1)本研究建立的紫外分光光度法測定紅活麻香豆素的含量測定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好。
　　(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HPD300大孔吸附樹脂提取純化