香蕉枯萎病菌GFP標(biāo)記和β-葡萄糖甘酶基因克隆.pdf

1、由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉的毀滅性病害，香蕉的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。目前，國內(nèi)香蕉生產(chǎn)尚無有效、穩(wěn)定的控制措施。深入研究香蕉枯萎病菌的致病特性和病菌的生理學(xué)、遺傳學(xué)特性，對進(jìn)一步研究香蕉枯萎病的發(fā)生與流行規(guī)律、研究有效的控制方法均有一定的理論意義和應(yīng)用價值。
　　 本研究將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein

2、, gfp)基因轉(zhuǎn)化入香蕉枯萎病菌，研究轉(zhuǎn)化后菌株的生物學(xué)特性以及在香蕉植株體內(nèi)的侵染特性，為進(jìn)一步研究香蕉枯萎病菌致病機(jī)理和生防提供理論基礎(chǔ)；同時克隆出香蕉枯萎病菌的β-葡萄糖甘酶基因，為研究此基因功能奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．香蕉枯萎病株采自福建省漳州，經(jīng)單孢分離、致病性測定與分子鑒定，獲得21個尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種。
　　 2．建立香蕉枯萎病菌的PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體法遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，香蕉枯萎病

3、菌的原生質(zhì)體的制備是整個轉(zhuǎn)化中最關(guān)鍵的一步，影響原生質(zhì)體制備因素很多主要包括合適的酶液、菌絲的菌齡、制備原生質(zhì)體的溶菌溫度和溶菌時間。本文轉(zhuǎn)化方法采用的是0.8mol·L-1的NaCl溶解的崩潰酶(Drislase)和溶壁酶(Lysing Enzyme)；菌齡10-14h的新鮮菌絲；28℃，70r·min-1消化酶解2-3h。
　　 3．對尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種Foc-3076菌株進(jìn)行g(shù)fp標(biāo)記。標(biāo)記后菌株的菌絲、分生

4、孢子、厚垣孢子的形態(tài)與親本菌株形態(tài)基本相同，且在紫外光下都呈現(xiàn)綠色熒光。PCR驗(yàn)證表明，目的基因已轉(zhuǎn)入到Foc-3076菌株。且標(biāo)記后菌株較之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在無選擇壓力條件下繼代培養(yǎng)6代，轉(zhuǎn)化子仍然保持強(qiáng)烈的綠色熒光。gfp基因標(biāo)記前后的菌株在菌落形態(tài)、最佳pH值和菌絲生長速度基本一致，菌株致病力未有明顯改變，發(fā)病率均達(dá)到90％以上。
　　 4．利用激光共聚焦顯微鏡掃描觀察結(jié)果表明，標(biāo)記病原菌侵染香蕉是以孢子萌