萬特普安在膀胱癌中的抑癌效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　萬特普安(銅綠假單胞菌注射液)是一種含有甘露糖敏感血球凝集素菌毛(MSHA)的銅綠假單胞菌(PA),可以識別并結(jié)合細(xì)胞表面的甘露糖受體,抑制腫瘤細(xì)胞上EGFR受體的活化,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞。目前已有研究證明對肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等在內(nèi)的腫瘤具有明顯的抗癌作用。但是該藥對膀胱癌是否具有抗癌效應(yīng),仍然沒有有效的證據(jù)支持。因此本實(shí)驗(yàn)研究主要探討萬特普安(PA-MSHA)對膀胱癌在體外及體內(nèi)的抗癌活性及其主要

2、機(jī)制。
　　方法：
　　1、選取正常尿路上皮細(xì)胞系(SV-HUC-1)和三種膀胱癌細(xì)胞系(T24,5637,HT-1376),分別經(jīng)不同濃度PA-MSHA處理24h,48h,72h后,通過CCK-8檢測法檢測藥物對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2、通過透射電鏡觀察PA-MSHA處理24h后膀胱癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測不同濃度藥物處理24h后膀胱癌細(xì)胞系的凋亡情況。
　　4、通過w

3、esternblot檢測經(jīng)藥物處理24h后膀胱癌細(xì)胞系凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),包括caspase-3,8,9,以及EGFR及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),包括EGFR,AKT和ERK。
　　5、將T24細(xì)胞接種于裸鼠皮下進(jìn)行荷瘤,待瘤體長出后,于瘤內(nèi)注射藥物,觀察藥物對瘤體的影響。
　　6、42天后,處死裸鼠取出腫瘤組織,通過TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況,通過westernblot檢測EGFR及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。

4、　　結(jié)果：
　　1、藥物處理后,可發(fā)現(xiàn)對三種膀胱癌細(xì)胞系均有明顯的抑制增殖效果,但是對SV-HUC-1效果較差。通過電鏡觀察可發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯的凋亡改變。
　　2、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)PA-MSHA處理后細(xì)胞凋亡,并且凋亡率隨藥物濃度增加而升高。westernblot結(jié)果顯示隨藥物濃度增加caspase-3,8,9表達(dá)量下降,而cleavedcaspase-3,8,9表達(dá)量上升。
　　3、進(jìn)一步檢測

5、細(xì)胞EGFR及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),可發(fā)現(xiàn)總EGFR,AKT,ERK的表達(dá)量不變,但是磷酸化蛋白的表達(dá)量隨濃度增加而下調(diào)。
　　4、經(jīng)藥物注射后,腫瘤體積與對照組相比明顯減少,瘤體生長緩慢并有減小趨勢。
　　5、TUNEL法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)PA-MSHA處理過的腫瘤組織凋亡明顯增加。
　　6、進(jìn)一步檢測腫瘤組織EGFR及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),可發(fā)現(xiàn)EGFR,AKT,ERK的蛋白總表達(dá)量不變,但是磷酸化蛋白的表達(dá)