小膠質細胞介導的IGF-1對新生大鼠腦缺血損傷修復的影響.pdf

1、背景：
　　 成體神經(jīng)發(fā)生終身存在于側腦室室管膜下區(qū)(subventricularzone，Svz)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)等腦內(nèi)某些特定區(qū)域，成體神經(jīng)干細胞(adultneuralstemcells，ANSCs)在腦內(nèi)的增殖和向著特定表型分化是由它們存在的小生境的特性決定的。在細胞水平，小膠質細胞、星型膠質細胞、室管膜細胞和血管內(nèi)皮細胞作為ANSCs小生境(niche)的組成部分已有不少的證據(jù);神經(jīng)免疫系

2、統(tǒng)的組成被提議作為ANSCs的小生境的組成部分影響ANSCs的增殖、分化和/或存活。大腦免疫細胞(尤其是小膠質細胞和星型膠質細胞)、外周免疫細胞(尤其是T細胞和巨噬細胞)、神經(jīng)元和成體神經(jīng)干細胞相互作用，維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自我更新，特別是先天免疫反應，尤其是小膠質細胞介導的免疫網(wǎng)絡作為ANSCs小生境最重要的組成部分而引人注目。
　　 小膠質細胞是定居在大腦實質的巨噬細胞，它們來自中胚層，而不像其它經(jīng)典神經(jīng)膠質細胞來自外胚層

3、，而是源自在大腦發(fā)育中侵入的單核細胞。近年來原林教授提出支持儲備系統(tǒng)及自體監(jiān)控系統(tǒng)新學說，認為由中胚層間充質分化成多個器官系統(tǒng)后，所遺留的部分形成遍布全身結締組織筋膜支架，筋膜以干細胞為中心為其它功能細胞的再生提供細胞支持和儲備-稱之為支持儲備系統(tǒng);該系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的參與下維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和功能狀態(tài)的調控-稱之自體監(jiān)控系統(tǒng)。小膠質細胞作為ANSCs的支持細胞和小生境細胞，主導神經(jīng)免疫網(wǎng)絡，與ANSCs相互作用，維持ANSC

4、s的自我更新和促使神經(jīng)發(fā)生調控信號傾向，這類小膠質細胞存在ANSCs的小生境中，形成小膠質細胞免疫網(wǎng)絡與ANSCs相互作用，其缺乏經(jīng)典M1小膠質細胞表型卻獨具M2小膠質細胞表型特性，作為ANSCs的支持細胞和小生境細胞維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自我更新。
　　 當腦缺血損傷時，小膠質細胞最早參與其炎癥反應，小膠質細胞在腦缺血損傷中扮演的是促神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)保護表型還是神經(jīng)毒性表型是近年神經(jīng)科學領域爭論最激烈的話題。眾所周知，小膠質細胞

5、在不同的條件扮演著神經(jīng)保護和神經(jīng)毒性的雙重角色，究竟是哪種角色，那就要看他們當時的激活狀態(tài)和功能表型，雖然早些研究顯示小膠質細胞涉及抑制神經(jīng)發(fā)生，抑制神經(jīng)發(fā)生的機制是通過介導促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18、單核細胞趨化蛋白1和各種各樣的氫和氮類的反應?？墒乾F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證實小膠質細胞作為促神經(jīng)發(fā)生表型在生理和一定的病理條件下支持神經(jīng)發(fā)生的不同階段，小膠質細胞通過表達主要組織相容性抗原復合物II

6、、IFN-γ、IL-4、TGF-β1和產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1、NGF、BDNF、NT-3、GDNF促使神經(jīng)發(fā)生。
　　 新生大鼠出生前后，SVZ和DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生持續(xù)存在，在出生后7天達高峰，可是隨著年齡的增加，神經(jīng)發(fā)生增殖能力不斷減弱;當新生大鼠在缺血缺氧腦損傷后，神經(jīng)發(fā)生增殖能力再次增強。大鼠出生后新生神經(jīng)元凋亡和缺血損傷后可以激活ANSCs的機制尚不清楚，有學者認為大鼠出生后新生神經(jīng)元凋亡是由于神經(jīng)發(fā)生區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子支

7、持不足所致，病理損傷后可以上調神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達促使神經(jīng)發(fā)生。本實驗使用7日齡新生大鼠雙側頸總動脈夾閉10min，建立新生大鼠短暫腦缺血模型(BilateralCommonCarotidArteryOcclusion,BCCAO)，誘導神經(jīng)發(fā)生區(qū)域DG和SVZ區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，通過觀察缺血早期DG區(qū)小膠質細胞的超微結構變化，和觀察缺血不同時間點DG區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1和ANSCs的增殖變化，最后使用IGF-1受體阻斷劑，阻斷I

8、GF-1的表達，再次觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)的ANSCs增殖變化，為臨床治療腦血管疾病提供新的策略。
　　 目的：
　　 研究7日齡新生大鼠短暫腦缺血誘導神經(jīng)發(fā)生，觀察小膠質細胞活化介導IGF-1對ANSCs增殖的影響，為內(nèi)源性ANSCs修復和細胞替代治療大腦缺血損傷疾病和神經(jīng)退行性疾病提供新的靶點;也為支持和儲備系統(tǒng)新學說提供部分實驗依據(jù)。
　　 1、通過透射電子顯微鏡技術觀察新生大鼠缺血損傷早期對DG區(qū)小膠質細胞

9、超微結構影響;
　　 2、通過免疫組織化學方法檢測缺血損傷不同時間點對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1表達的影響;
　　 3、通過免疫組織化學方法檢測缺血損傷不同時點對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖的影響
　　 4、使用IGF-1阻斷劑(JB1)阻斷IGF-1的表達后，通過免疫組織化學方法檢測，缺血損傷對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達的影響
　　 5、使用JB1阻斷IGF-1

10、表達后，通過免疫組織化學方法檢測，缺血損傷對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖變化的影響。
　　 方法：
　　 1、7日齡新生大鼠制作短暫腦缺血模型，分離皮下組織后，再分離頸總動脈和迷走神經(jīng)，使用動脈夾夾閉雙側頸總動脈10min，作為短暫腦缺血模型(BCCAO);假手術模型(SS)，分離皮下組織、頸總動脈和迷走神經(jīng)，不使用動脈夾夾閉雙側頸總動脈。
　　 2、7日齡新生大鼠70只隨機分為缺血組(BCCAO)(n

11、=27)、假手術組(SS)組(n=27)、缺血+阻斷劑組(BCCAO+JB1)(n=8)和缺血+生理鹽水組(BCCAO+SS)(n＝8)。短暫腦缺血后連續(xù)7d皮下注射IGF-1受體阻斷劑JB1作為BCCAO+JB1組，而短暫腦缺血后連續(xù)7d皮下注射等量體積的生理鹽水作為BCCAO+SS組。
　　 3、BCCAO組(n=3)和SS組(n=3)，在缺血后1d，利用透射電鏡技術觀察DG區(qū)小膠質細胞的超微結構變化。
　　 4、B

12、CCAO組(n＝24)和SS組(n＝24)，在缺血后1d、4d和7d利用免疫組織化學技術觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1的表達量和ANSCs的增殖變化情況(不同缺血時間點灌注前6h、4h和2h皮下注射BrdU標記ANSCs的增殖)。
　　 5、BCCAO+JB1組(n＝8)和BCCAO+SS組(n＝8)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，然后利用免疫組織化學技術觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達情況和ANSCs的增殖變化情況(灌注前

13、6h、4h和2h皮下注射BrdU標記ANSCs的增殖)
　　 結果：
　　 1、利用透射電鏡技術觀察發(fā)現(xiàn)，在短暫缺血后早期即缺血后1d新生大鼠DG區(qū)小膠質細胞從SS組靜息狀態(tài)的桿狀結構變?yōu)锽CCAO組激活狀態(tài)的鋸齒狀結構。
　　 2、利用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，與同時間點SS組比較，缺血后1d、4d、7d的DG區(qū)和SVZ區(qū)的新生細胞和IGF-1陽性細胞數(shù)目均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)
　　

14、3、利用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，BCCAO+JB1組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達缺如，BCCAO+SS組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達正常。
　　 4、利用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，BCCAO+JB1組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)的新生細胞顯著減少，與BCCAO+SS組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 新生大鼠缺血

15、再灌注損傷激活了免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(immuno-neuro-endocrinenetwork，INEN)，最先激活的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的先天免疫細胞即小膠質細胞，尤其最早發(fā)生在對缺血敏感的海馬區(qū)域。本實驗發(fā)現(xiàn)在缺血早期即在缺血后1d小膠質細胞大量聚集在神經(jīng)發(fā)生的特定區(qū)域DG區(qū)，其形態(tài)也從靜息狀態(tài)的桿狀結構變?yōu)榧せ顮顟B(tài)的鋸齒狀結構，其缺乏經(jīng)典M1小膠質細胞表型的溶酶體結構，表明在缺血早期小膠質細胞就參與神經(jīng)發(fā)生，小膠質細胞形態(tài)學結構改

16、變的基礎，正好解釋了促神經(jīng)發(fā)生即神經(jīng)保護這一小膠質細胞功能表型;活化的小膠質細胞通過自身表達或通過與星型膠質細胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞或外周的T細胞相互作用上調IGF-1表達，從而促使DG區(qū)和SVZ區(qū)的ANSCs增殖。當使用IGF-1受體阻斷劑后，IGF-1表達被阻斷，DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖顯著減少，提示小膠質細胞活化介導的IGF-1有利于大腦缺血損傷的修復。
　　 綜上所述，小膠質細胞介導的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡與成體