IGF-1基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療HIBD新生大鼠的研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是新生兒期常見的疾病，是指由各種原因，主要指圍生期窒息，引起的腦組織部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而造成的神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡、壞死，腦水腫，腦室周圍白質(zhì)囊泡化，繼發(fā)腦組織重建，導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)及功能受損，造成相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，并且出現(xiàn)嚴(yán)重的后遺癥，是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，新生兒后期神經(jīng)系統(tǒng)傷殘(智力低下、癲癇、腦癱)的主要原因之

2、一。近年來，隨著新生兒搶救技術(shù)的日益提高，腦損傷的發(fā)病率不但未降，反而有升高趨勢。目前的治療方法旨在緩解癥狀和控制更進(jìn)一步的腦損傷，療效欠佳。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)以其自我更新、持續(xù)分裂增殖能力及多潛能分化的特點(diǎn)，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，整合入宿主組織的神經(jīng)環(huán)路，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想種子細(xì)胞。在神經(jīng)干細(xì)胞來源方面，與神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞移植治療中其它細(xì)胞來源相比，臍血

3、干細(xì)胞以其來源豐富，抗原性弱，移植物抗宿主病發(fā)生率低、反應(yīng)輕，不涉及社會倫理道德及法律等優(yōu)勢成為神經(jīng)干細(xì)胞的新來源。因此使用臍血干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為NSCs用于臨床研究有廣闊的應(yīng)用前景；同時神經(jīng)干細(xì)胞是基因轉(zhuǎn)染的良好載體，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將目的基因通過載體(如脂質(zhì)體、病毒、多種陽離子物質(zhì)及磷酸鈣等)轉(zhuǎn)染入神經(jīng)干細(xì)胞，待檢測出其穩(wěn)定表達(dá)后，再將含有目的基因的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植?；蛐揎椀纳窠?jīng)干細(xì)胞不但可以起到細(xì)胞替代的作用，而且目的基因

4、分泌的營養(yǎng)因子可以改善腦損傷局部的內(nèi)環(huán)境促進(jìn)軸索的再生。胰島素樣生長因子1(Insulin like Growth Factor-1，IGF-1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和成熟的全過程中發(fā)揮著重要作用，是促進(jìn)大腦發(fā)育所必需的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1對一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性、退行性及神經(jīng)毒性等疾病具有明顯的治療作用，可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抑制神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡，減輕傷后功能喪失，促進(jìn)傷后功能重建。既往的研究顯示單用IGF-1因

5、子或單獨(dú)移植NSCs均能對動物HIBD模型發(fā)揮重要的治療作用，本課題采用NSCs移植和IGF-1聯(lián)合，即將IGF-1基因轉(zhuǎn)染NSCs，通過移植基因工程化的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs-IGF-1)，探討對HIBD的治療作用。
　　 目的：⑴研究臍血源性NSCs體外分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的方法，觀察細(xì)胞增殖分化情況。⑵構(gòu)建人IGF-1基因質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-IGF-1，轉(zhuǎn)染到臍血源性NSCs內(nèi)，構(gòu)建基因工程化的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs

6、-IGF-1)。⑶將NSCs-IGF-1移植新生大鼠HIBD模型中，觀察神經(jīng)干細(xì)胞在宿主腦內(nèi)的存活及遷移分布情況，并對腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的情況進(jìn)行研究，為臨床上應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染NSCs移植治療HIBD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
　　 方法：①采用密度梯度離心法從人臍血中分離出單個核細(xì)胞，用hEGF、bFGF和B27因子定向誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，觀察培養(yǎng)過程中臍血單個核細(xì)胞增殖分化的特點(diǎn)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物

7、Nestin、NSE、GFAP的表達(dá)情況；BrdU試劑標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞，并測定BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)率。②通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法從人胎肝中提取IGF-1基因，膠回收的方法分別純化PCR產(chǎn)物(IGF-1基因)和質(zhì)粒pcDNA3.1，二者分別由DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與HindⅢ雙酶切后，經(jīng)T4 DNA Ligase連接的方法將IGF-1基因克隆到質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1中，采用測序方法及DNA限制性內(nèi)切酶BamH

8、Ⅰ與HindⅢ雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒。③脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體pcDNA3.1-IGF-1及空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)G418抗性篩選后，利用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法檢測IGF-1基因在基因轉(zhuǎn)染臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。④7日齡75只新生SD大鼠通過結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，及缺氧處理的方法制備HIBD動物模型。75只HIBD大鼠被隨機(jī)分成NSCs移植組、模型對照組、NSCs-IGF-1移植組，每組25只

9、，再進(jìn)一步隨機(jī)分為1d、7d、14d、21d組及神經(jīng)功能檢測組，每組5只。移植前3天，將NSCs移植組及NSCs-IGF-1移植組細(xì)胞行BrdU標(biāo)記(終濃度1μmol/L)。造模后24小時，調(diào)整細(xì)胞濃度(1×106/L)，采用尾靜脈注射法進(jìn)行干細(xì)胞移植。25只不進(jìn)行造模，且不移植任何細(xì)胞的正常SD大鼠為正常對照組。造模后的SD大鼠行NSCs-IGF-1移植的為NSCs-IGF-1移植組，造模后的SD大鼠在相同部位行NSCs移植的為NSC

10、s組，造模后的SD大鼠行等量生理鹽水注射對照的為模型對照組。⑤每組隨機(jī)抽取5只動物，在移植后1d、7d、14d、21d處死，免疫熒光技術(shù)檢測BrdU的表達(dá)，對移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)的存活及遷移進(jìn)行檢測。Y-迷宮試驗(yàn)檢測腦損傷大鼠神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)功能及記憶功能的恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果：⑴臍血單個核細(xì)胞體外經(jīng)過分離，直接加入hEGF、bFGF和B27因子進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可得到NSCs克隆團(tuán)，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記Nestin、NSE及GFA

11、P。P3代NSCs經(jīng)BrdU標(biāo)記，陽性率達(dá)90％。⑵IGF-1基因從人胎肝中成功提取。重組體pcDNA3.1-IGF-1經(jīng)基因序列測定及DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與HindⅢ雙酶切證實(shí)質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-IGF-1構(gòu)建正確。重組體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染臍血源性NSCs24小時后，經(jīng)G418篩選10-14天得到細(xì)胞抗性克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到IGF-1基因在重組質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染的臍血源性NSCs中成功表達(dá)

12、。RT-PCR方法檢測到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染的臍血源性NSCs中IGF-1mRNA表達(dá)陽性，而空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的臍血源性NSCs中IGF-1mRNA表達(dá)陰性。⑶BrdU對NSCs移植HIBD動物模型示蹤顯示，BrdU陽性細(xì)胞在NSCs-IGF-1組及NSCs組均可見。由靜脈途徑移植的BrdU陽性細(xì)胞能遷移到HIBD大鼠腦內(nèi)，隨著時間的推移趨化至損傷側(cè)室管膜下區(qū)存活。移植第7d后，與NSCs移植組相比較，NS

13、Cs-IGF-1移植組BrdU陽性率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑷IGF-1基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs-IGF-1)移植可以更好改善腦損傷大鼠學(xué)習(xí)及記憶功能。
　　 結(jié)論：①臍血單個核細(xì)胞體外可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，臍血可成為神經(jīng)干細(xì)胞的一種新來源。②IGF-1基因可在重組質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染的臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。③IGF-1基因轉(zhuǎn)染的NSCs具有更強(qiáng)的分裂增殖能力。④N