嗜卷書虱乙酰膽堿酯酶生化毒理學(xué)及其基因克隆與序列分析.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(AcIetylcholinesteraSe，ACHE；EC 3.1.1.7)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，能夠迅速水解興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿而保持神經(jīng)突觸傳導(dǎo)的正常進(jìn)行，是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)。害蟲可以通過(guò)體內(nèi)ACHE質(zhì)與量的變異而對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。為了闡明AChE在嗜卷書虱抗性中的作用和地位，以及AChE介導(dǎo)的抗性機(jī)理。本論文以重要的儲(chǔ)糧害蟲嗜卷書虱 (Liposcelis bostrychophi

2、la Badonnel)為試驗(yàn)材料，通過(guò)室內(nèi)飼養(yǎng)并培育出嗜卷書虱的DDVP和PH<,3>抗性品系(DDVP-R和PH<,3>-R)，較為系統(tǒng)地對(duì)兩種抗性品系與敏感品系體內(nèi)的ACHE，從生化毒理學(xué)以及基因克隆兩個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行研究。主要結(jié)果如卜： 一、嗜卷書虱ACHE的生化毒理學(xué)特性采用微量滴度酶標(biāo)板法，對(duì)嗜卷書虱敏感品系以及2個(gè)抗性品系(DDVP-R，RF=22.36和PH<,3>-R，RF=4.51) ACHE的生化毒理學(xué)特性進(jìn)

3、行了較為系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)，嗜卷書虱敏感品系、DDVP-R和PH<,3>-R的酶源蛋白含量之間存在顯著性差異，且2個(gè)抗性品系均顯著低于敏感品系。DDVP-R和PH<,3>-RAChE的比活力顯著高于敏感品系。酶動(dòng)力學(xué)特性研究表明，以STChI為底物，兩個(gè)抗性品系的動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間存在顯著的差異。PH<,3>-R的K<,m>值較敏感品系顯著升高；同時(shí)，PH<,3>-R的V<,max>值顯著大于敏感品系，說(shuō)明該抗性品系的ACHE發(fā)生了質(zhì)的變

4、化：同時(shí)，V<,max>的升高表明該抗性品系中可能存在AChE的過(guò)量表達(dá)。這種過(guò)表達(dá)可能是殺蟲劑和熏蒸劑持續(xù)不斷選擇壓力下篩選的結(jié)果。DDVP-R的K<,m>和V<,max>較敏感品系均無(wú)顯著變化。 對(duì)嗜卷書虱AChE的殺蟲劑離體抑制研究作用表明，所選用的六種殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱各品系A(chǔ)ChE都有明顯的離體抑制作用。根據(jù)測(cè)得的抑制中濃度(I<,50>)可以看出，與敏感品系相比，2個(gè)抗性品系對(duì)于敵敵畏、對(duì)氧磷、馬拉氧磷和甲基內(nèi)吸磷的敏

5、感性顯著降低：PH<,3>-R對(duì)于西維因和毒扁豆堿的敏感性亦顯著下降，而DDVP-R與敏感品系間無(wú)顯著差異。以上研究結(jié)果表明，2個(gè)抗性品系都存在著對(duì)藥劑的普遍不敏感性。 二、嗜卷書虱ACHE基因的克隆根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已知的嗜卷書虱AChE cDNA片段設(shè)計(jì)特異引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，成功的從嗜卷書虱敏感品系中克隆到了編碼ACHE的全長(zhǎng)基因，該基因全長(zhǎng)2162bp，包括由181個(gè)核苷酸組成的5’非編碼區(qū)序列、由1

6、914個(gè)核苷酸組成的ORF和由67個(gè)核苷酸組成的3’非編碼區(qū)序列。ORF編碼637個(gè)氨基酸組成的ACHE前體蛋白，其中包括了由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。 三、嗜卷書虱ACHE的同源性、功能位點(diǎn)、分子進(jìn)化分析和同源建模將嗜卷書虱AChE氨基酸序列提交到NCBI，進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)(BLASTP)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列同時(shí)具有Esterase-lipase和COesterase的保守結(jié)構(gòu)域，且具有完整的N端和C端。該序列與黑尾葉蟬Ne

7、photetix cincticeps AChE的同源性最高，達(dá)到77％，與其他昆蟲的AChE也都具有較高的同源性。通過(guò)對(duì)嗜卷書虱、果蠅和電鰩AChE的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆獲得的嗜卷書虱AChE具有AChE家族所有的保守性功能位點(diǎn)：(1)保守的催化三聯(lián)體$239，E368，H482(2)六個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成三對(duì)二硫鍵(C86-113，C293-308，C444-560)；(3)保守的氧陰離子洞G151，G152，A240；

8、(4)FGESAG序列。另外與電鰩乙酰膽堿酯酶相比，嗜卷書虱乙酰膽堿酯酶活性位點(diǎn)谷內(nèi)排列的9個(gè)芳香族氨基酸殘基是保守的(W103，W147，Y163，W272，W322，F(xiàn)331，F(xiàn)372，Y375，W474)。 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了來(lái)自31個(gè)物種的45個(gè)AChE氨基酸序列，結(jié)合嗜卷書虱的AChE氨基酸序列，利用MEGA3.0構(gòu)建了AChE的分子進(jìn)化樹。結(jié)果表明用于分析的所有的AChE基本可以分為4個(gè)大的類群：昆蟲AC

9、HE1類群、脊椎動(dòng)物AChE類群、昆蟲ACHE2類群、線蟲AChE類群。嗜卷書虱 AChE 基因?yàn)楹诟构堿ChE基因的直向同源基因(orthologousgene)，即Ⅱ型 AChE 基因。 以果蠅(1d×4A)AChE已知的蛋白晶體結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)嗜卷書虱的AChE進(jìn)行了同源建模，得到的嗜卷書虱AChE的模擬三維結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)比電鰩的活性位點(diǎn)氨基酸，在結(jié)構(gòu)中相應(yīng)位置找到了嗜卷書虱AChE的酶解活性位點(diǎn) (催化三聯(lián)體：Ser23