果蠅乙酰膽堿酯酶基因在畢赤酵母中的表達.pdf

1、乙酰膽堿酯酶（Acetycholinesterase,AChE）是存在于中樞神經系統(tǒng)內的一種水解酶，經典作用是水解神經遞質乙酰膽堿（Ach），終止神經沖動的傳導。常見的殘留農藥主要是有機磷和氨基甲酸酯類藥劑，通過抑制昆蟲中樞神經中的膽堿酯酶使之死亡而發(fā)揮殺蟲作用。因此，AChE作為此類農藥的最適反應底物，在農藥殘留的快速檢測中得到了廣泛應用，尤其是基于AChE的生物傳感器已成為農殘檢測中的熱點。 目前，AChE主要從家蠅等敏感昆

2、蟲頭部提取，產量低，成本高、靈敏度變幅大。因此，通過分子生物學方法克隆敏感AChE基因，構建高效表達載體表達AChE基因并且分離純化目標蛋白，利用基因工程手段大量制備活性蛋白具有重要的研究意義和廣闊的市場前景。果蠅AChE（Drosophila melanogaster AChE,DmAChE）對有機磷和氨基甲酸酯類農藥敏感度極高，并且已經得到相應基因的全長核苷酸序列。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)經過近十年發(fā)展，已

3、基本成為較完善的外源基因表達系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產物有效分泌并適當糖基化，培養(yǎng)方便經濟等特點。我們構建DmAChE的畢赤酵母表達系統(tǒng)，目的就是探索AChE基因在P.pastoris表達系統(tǒng)中高效、穩(wěn)定表達的條件，為大量制備乙酰膽堿酯酶提供有效的基因工程手段。 本研究應用分子生物學PCR方法擴增DmAChE基因編碼區(qū)全長1.9Kb cDNA序列；選取畢赤酵母表達載體pPIC9K，選用Sna

4、BI/NotI內切酶把DmAChE基因克隆于表達載體的多克隆位點上，構建重組質粒pPIC9K-DmAChE。重組質粒經PCR、酶切驗證并且測序后，采用電穿孔法轉化入畢赤酵母表達菌株KM71，PCR方法檢測重組情況，篩選陽性轉化子。同時，G418抗性篩選高拷貝轉化子。重組酵母進行誘導表達，并應用改良的Ellman法檢測表達產物的AChE活性，于表達產物上清液中成功的檢測到了乙酰膽堿酯酶活性，并對不同基因拷貝數(shù)轉化子表達產物的乙酰膽堿酯酶活