擬環(huán)紋豹蛛乙酰膽堿酯酶功能驗(yàn)證與新乙酰膽堿酯酶基因克隆.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是催化乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的絲氨酸水解酶，主要分布于膽堿能神經(jīng)末梢突觸間隙，多集中在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)突觸后膜的褶皺中，其主要作用是終止膽堿能神經(jīng)沖動(dòng)、保證信號(hào)分子正常傳導(dǎo)，在神經(jīng)傳導(dǎo)中擔(dān)任重要的角色。乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的主要作用靶標(biāo)，殺蟲(chóng)劑使乙酰膽堿酯酶活性部位磷?；蛘甙被柞ｕセ瘡亩种埔阴Ｄ憠A酯酶的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸處

2、積累，引起突觸后膜上的乙酰膽堿受體過(guò)度興奮，破壞了神經(jīng)信號(hào)正常傳導(dǎo)，產(chǎn)生中毒癥狀，最終造成昆蟲(chóng)死亡。擬環(huán)紋豹蛛Pardosapseudoannulata分布于亞洲大部分稻田之中，屬于廣譜性捕食性天敵，主要捕食對(duì)象為褐飛虱，其體型大，種群數(shù)量多，空間生態(tài)位寬，捕食能力強(qiáng)，在稻田害蟲(chóng)防治中發(fā)揮著重要作用。如今，生態(tài)環(huán)境的惡化使得人們?cè)桨l(fā)意識(shí)到環(huán)境保護(hù)的重要性，如何更好地開(kāi)發(fā)利用自然天敵控制害蟲(chóng)已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。
　　目前國(guó)內(nèi)外的研

3、究大多集中于殺蟲(chóng)劑對(duì)天敵生物毒性等方面，鮮有關(guān)于其對(duì)害蟲(chóng)和天敵藥劑選擇性機(jī)理的研究報(bào)道，本研究通過(guò)RNAi技術(shù)驗(yàn)證了擬環(huán)紋豹蛛AChE1和AChE2對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感性的差異。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)室擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中曾發(fā)現(xiàn)多個(gè)注釋為AChE的基因片段，它們與其它物種的AChE具有很高的相似度，這表明擬環(huán)紋豹蛛中可能含有多個(gè)不同的ace基因，本文成功克隆了擬環(huán)紋豹蛛4個(gè)新的乙酰膽堿酯酶基因，通過(guò)與部分昆蟲(chóng)的乙酰膽堿酯酶氨基酸序列對(duì)比，分析有機(jī)磷和

4、氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑在蜘蛛與昆蟲(chóng)中的選擇毒力。
　　一、利用RNAi驗(yàn)證擬環(huán)紋豹蛛AChE1與AChE2的功能
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，克隆了擬環(huán)紋豹蛛AChE1(PpAChE1)和AChE2(PpAChE2)基因，并分析了外源重組酶的動(dòng)力學(xué)特征與殺蟲(chóng)劑敏感性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PpAChE1與PpAChE2在殺蟲(chóng)劑敏感性中的差異，本章建立了一種適用于擬環(huán)紋豹蛛的RNAi方法，通過(guò)顯微注射法將dsRNA導(dǎo)入擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)，注射位

5、置為腹側(cè)接近性腺處，50nL為最佳注射體積，60h為RNAi效率最佳時(shí)間點(diǎn)。RNAi結(jié)果顯示，沉默PpAChE1和PpAChE2編碼基因，均導(dǎo)致有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑敏感性變化，說(shuō)明兩者可能都是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)，但PpAChE1是主要的靶標(biāo)酶。此外，沉默PpAChE2幾乎不改變蜘蛛對(duì)氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的敏感性，沉默PpAChE1顯著改變敏感性，說(shuō)明氨基甲酸酯殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)酶為PpAChE1，而PpAChE2可能不是其靶標(biāo)酶。由此可見(jiàn)，比較兩個(gè)

6、乙酰膽堿酯酶，PpAChE1是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和氨基甲酸酯殺蟲(chóng)劑的主要靶標(biāo)。
　　二、擬環(huán)紋豹蛛4個(gè)新乙酰膽堿酯酶基因的克隆與序列分析
　　利用本實(shí)驗(yàn)室擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇與蛛形綱和昆蟲(chóng)綱乙酰膽堿酯酶相似性最高的4個(gè)unigene，在PCR驗(yàn)證序列的基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)克隆獲得4個(gè)可能的乙酰膽堿酯酶基因全長(zhǎng)。這4個(gè)可能的乙酰膽堿酯酶基因編碼的氨基酸具有乙酰膽堿酯酶的典型特征，包括氧陰離子洞，膽堿結(jié)合位點(diǎn)，催化三聯(lián)體，六

7、個(gè)半胱氨酸形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，覆蓋絲氨酸Ser200活性位點(diǎn)在內(nèi)的FGESA保守序列等關(guān)鍵位點(diǎn)。但是，個(gè)別推到的氨基酸序列存在保守性位點(diǎn)上的區(qū)別，重要膽堿結(jié)合位點(diǎn)Trp84被Tyr替代，催化三聯(lián)體Glu327被Asp取代，AChE的典型特征序列“FGESAG”在這4個(gè)基因中也發(fā)生輕微的氨基酸變化，此外14個(gè)芳香氨基酸中保守的數(shù)目也不盡相同。說(shuō)明本研究克隆的4個(gè)基因可能均為擬環(huán)紋豹蛛的AChE基因，但需要進(jìn)一步功能驗(yàn)證。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以及