重組人乙酰膽堿酯酶的表達純化及其抑制劑篩選.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)作為一種存在于膽堿能突觸間隙的由蛋白質(zhì)分子構成的生物催化劑，屬于生物神經(jīng)傳導中的一種關鍵性的酶。它不僅參與細胞的生長以及發(fā)育，同時對神經(jīng)的再生和神經(jīng)元的發(fā)育也有促進作用，并對維持人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能占有著非常重要的地位。乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)是AChE的水解底物，ACh會受AChE的催化發(fā)生裂解反應，導致ACh的缺失，從而使得各神經(jīng)信號傳遞失

2、敗。而ACh水平的降低或活性的異常則是造成阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)發(fā)生的主要原因。近年來，通過提高ACh的水平來治療AD，這已經(jīng)成為目前主要的治療方式。因此，通過抑制AChE來恢復或提高ACh的水平是治療AD持續(xù)有效的方法。乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesteraseinhibitor, AChEI)能夠選擇性的抑制腦內(nèi)AChE的活性，使ACh在大腦內(nèi)的存留時間延長，提高AD病人的膽堿

3、神經(jīng)功能，同時也能有效緩解病人的認知能力障礙降低病人。
　　迄今為止，對于輕、中度的AD治療AChEI已經(jīng)成為主流產(chǎn)品。經(jīng)美國FDA批準上市的6種AChEI，它們分別是他克林(Tararine)、加蘭他敏(Galanthamine)、利伐司替明(Rivastigmine)、石杉堿甲(HuperzineA)以及復方新藥Namzari和多奈哌齊(Donepezil，E2020)，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AChEI還有較多缺點存在，例如半衰期短、

4、毒性大以及較嚴重的膽堿能外周系統(tǒng)的副作用等，這使得它們在臨床應用上面受到一定限制。因此，尋找發(fā)現(xiàn)作用時間長、副作用小的新一代AChEI仍是目前治療AD藥物的研究熱點。
　　本研究旨在利用體外人胚腎(HEK293)細胞建立表達重組人乙酰膽堿酯酶（Recombinant human acetylcholinesterase，rhAChE）的表達系統(tǒng)，使用pCMV-AChE質(zhì)粒對其進行瞬時轉染，分泌表達酶液到培養(yǎng)基，并通過對酶動力學的研

5、究來考察重組表達蛋白的酶活性。使用DEAE-Sepharose FF親和層析對高效表達的重組蛋白進行純化，以獲得純度較高、活性較強的重組人乙酰膽堿酯酶，從而建立重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑的體外評價篩選模型，并應用該模型從天然產(chǎn)物及其衍生物中篩選其中藥抑制劑和對一系列化合物的抑制活性的測定。
　　1、HEK293細胞分泌表達重組人乙酰膽堿酯酶(rhAChE)
　　pCMV-AChE質(zhì)粒由浙江大學藥學院所贈送。測定pCMV-ACh

6、E的DNA序列確證AChE部分與AChE結構基因序列(GenBankAccessionNo:NM--000665)一致。通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導pCMV-AChE從而對HEK293細胞進行瞬時轉染。建立此表達系統(tǒng)分泌表達的rhAChE至細胞培養(yǎng)液中，收集細胞培養(yǎng)液作為酶液，進行AChE活性分析，最終獲得粗酶液進行下一步純化。
　　2、rhAChE活性和檢測體系研究
　　采用改進的Ellman

7、方法進行酶活檢測:反應體系中加入酶液和顯色劑DTNB(5，5'-二硫代雙-2-二硝基苯甲酸)，pH為7.4的PBS，在37℃培養(yǎng)箱孵育6 min，加入底物碘化硫代乙酰膽堿(ATCh)后37℃繼續(xù)孵育16 min，最后加入SDS終止反應，使用酶標儀測定在412 nm下的吸光度(OD值)，rhAChE的反應速率單位用OD/min來表示。
　　3、rhAChE的純化和鑒定
　　為獲得純度更高、活性更強的rhAChE，對收集的細胞培

8、養(yǎng)液即酶液進行活性分析后，通過透析過夜，使用DEAE-Sepharose FF親和層析柱梯度洗脫純化，收集蛋白純化液，進行活性檢測，聚乙二醇4000進行5倍濃縮，BCA蛋白濃度試劑盒測得蛋白濃度為0.145 mg/mL，純化液比活力為6.55 U/mg，純化倍數(shù)為9.63，酶活回收率為56％。該酶的相對分子質(zhì)量約為64 KD。以碘化硫代乙酰膽堿為底物時，酶的最適反應溫度為37℃，最適pH為7.4，最適底物濃度為5 mmol/L。進行SD

9、S-PAGE、Native-PAGE鑒定，在分子量64 KD附近出現(xiàn)明顯的rhAChE的單一條帶。純化液進行Western blot分析，一抗為Anti-AChE antibody抗體，在分子量64 KD附近出現(xiàn)明顯rhAChE單一條帶。
　　由于重組人乙酰膽堿酯酶的純度會直接決定最終檢測的準確性和可靠性，本實驗對人的乙酰膽堿酯酶的分離純化及生物學方面的意義做了研究，即如何使rhAChE的純化效率達到最大，減少及簡化純化步驟，使酶

10、活的損失降低，以提高純化的倍數(shù)。
　　4、rhAChE抑制劑的篩選
　　多奈哌齊對AChE是可逆性的抑制劑，其在粗酶液的IC50為14.0 nmol/L。本研究選擇7個濃度來測定多奈哌齊對純化液rhAChE的抑制率效果，以化合物摩爾濃度的負對數(shù)和酶抑制率進行線性回歸，求取IC50值。反應體系條件:pH7.4，酶量5μL，多奈哌齊濃度:0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160 nmol/L，底物濃度:0.5