P120連環(huán)蛋白亞型三的磷酸化增強(qiáng)攜帶Kaiso出核促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲.pdf

1、目的：
　　 Armadillo連環(huán)蛋白家族中的P120連環(huán)蛋白（p120-catenin，p120ctn）在胞膜與E-鈣（E-cadherin）結(jié)合可以調(diào)節(jié)鈣粘素的粘附力和穩(wěn)定性，在胞漿通過(guò)與小Rho GTPase的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞骨架的重構(gòu)。近年來(lái)，大量研究表明p120ctn還穿梭于核漿，在核內(nèi)解除轉(zhuǎn)錄抑制因子Kaiso蛋白對(duì)其下游候選靶基因matrilysin（MMP-7）、MTA2等的轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　 已有

2、大量的文獻(xiàn)報(bào)道了p120ctn的磷酸化狀態(tài)對(duì)E-cadherin和Rho GTPase的穩(wěn)定性有明顯的調(diào)節(jié)作用，而核內(nèi)的p120ctn的磷酸化狀態(tài)對(duì)其功能具有什么樣的影響，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。有研究表明p120ctn通過(guò)其入核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）和出核信號(hào)（nuclear export signal，NES）進(jìn)出核，而Kaiso僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)入核定位信號(hào)NLS，尚未發(fā)現(xiàn)其出核信號(hào)NES。有研

3、究發(fā)現(xiàn)Kaiso無(wú)論在細(xì)胞漿，還是在細(xì)胞核的定位總是有p120ctn相伴隨。P120ctn的絲氨基酸288位的磷酸化（Phosphorylated serine 288，Ps288）又常常出現(xiàn)在核內(nèi)，因此我們猜想p120ctn在核內(nèi)的磷酸化狀態(tài)可能影響了與Kaiso的結(jié)合，Kaiso很可能是以與p120ctn結(jié)合的形式被帶出核的。
　　 我們?cè)贏549、H460等細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)染p120ctn相關(guān)質(zhì)粒，并分別加入經(jīng)典的出核途徑抑

4、制劑以阻止p120ctn的出核；加入相關(guān)藥物用以改變p120ctn蛋白分子上絲、蘇氨酸的磷酸化狀態(tài)，分別觀(guān)察了p120ctn和Kaiso蛋白的核、漿分布，探討了p120ctn核定位和磷酸化狀態(tài)對(duì)與Kaiso結(jié)合能力、Kaiso下游基因的轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)及處置
　　 所用的肺癌細(xì)胞系BE1和LH7為來(lái)自于PG肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系（北京醫(yī)科大學(xué)陳杰教授饋贈(zèng)）；肺大細(xì)胞癌NCI

5、-H460、NCI-H661，肺腺癌LTEP-a-2、SPC-A-1，肺鱗癌SK-MES-1，肺小細(xì)胞癌NCI-H446細(xì)胞系均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)：HBE為人永生化的正常支氣管上皮和肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于美國(guó)。在37度無(wú)菌環(huán)境、10％的胎牛血清，5％的二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的血清饑餓用含0.1％的DMEM，饑餓16小時(shí)；血清恢復(fù)用10％DMEM，恢復(fù)30分鐘；萊普霉素B處置劑量50nM，時(shí)間為18小時(shí)；PMA應(yīng)用劑量200n

6、M，作用時(shí)間為30分鐘；BisI的施用劑量為1μM，時(shí)間為10分鐘。
　　 2、質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　 Mp120-1A、mp120-3A模板由美國(guó)Vanderbilt大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室構(gòu)建的，由Reynolds B.Albert教授饋贈(zèng)。P120-NLS-1A、3A質(zhì)粒為在mp120-1A、3A的基礎(chǔ)上構(gòu)建的強(qiáng)制入核質(zhì)粒，用PCR的方法擴(kuò)增了原質(zhì)粒中的P120-1A、3A全長(zhǎng)基因，酶切PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pCMV/my

7、c/nuc/GFP，將全長(zhǎng)基因連接到pCMV/myc/nuc/GFP載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上。提取質(zhì)粒并送大連TaKaRa生物公司測(cè)序。pBluescript-Kaiso質(zhì)粒是由加拿大Mcmaster大學(xué)生物學(xué)教研部門(mén)構(gòu)建，由Juliet M.Daniel教授饋贈(zèng)。由TaKaRa生物公司合成的人類(lèi)P120總siRNA序列如下：A：5’-GGATCACAGTCACCTTCTA-3’：5’-TAGAAGGTGACTGTGATCC-3B：5’-G

8、CACTTGTATTACAGACAA-3’：5’-TTGTCTGTAATACAAGTGC-3’C：5’-GGATAACAAGATTGCCATA-3’：5’-TATGGCAATCTTGTTATCC-3’用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000參照操作說(shuō)明書(shū)完成瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建。
　　 3、免疫熒光
　　 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定、打孔、封閉后加入P120鼠單抗（1:200），Kaiso羊多抗（1:1

9、00），Kaiso鼠單抗（1:200），Ps288鼠單抗（1:200），濕盒中4度中孵育過(guò)夜。一抗孵育完畢，于暗室中加入二抗，抗鼠二抗FITC（1:100）、抗羊二抗TRITC（1:100）、Hoechst（1:200）。最后用熒光顯微鏡觀(guān)察并照相。
　　 4、核漿蛋白的分離、免疫共沉淀和Wrestern-blot
　　 參照核漿蛋白試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核漿蛋白抽提?？偟鞍准昂藵{抽提的蛋白用Bradford法測(cè)其濃度。免

10、疫共沉淀的總蛋白經(jīng)過(guò)加入誘餌抗體孵育、Protein G microbeads孵育后，分離并收集其免疫復(fù)合物。樣本可以進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5％的脫脂奶粉或5％的BSA搖床上封閉后，加入一抗p120單抗（1:800），Ps288單抗（1:500），kaiso單抗（1:400），內(nèi)參Actin（1:400），LaminB1（1:400），Tubulin（1:200），4度孵育過(guò)夜。取出孵育后的膜用相應(yīng)二抗（1

11、:4000.1:8000）室溫孵育2小時(shí)后于暗室進(jìn)行ECL顯色。
　　 5、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）
　　 用TRIzol Reagent提取細(xì)胞總的RNA。用RNA PCR試劑盒依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。用1.5％的瓊脂糖膠并加入了0.1μg/μl的溴化乙腚電泳。相對(duì)RNA的量是用目的條帶與β-ac

12、tin的條帶相比得出的值。
　　 6、Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲試驗(yàn)
　　 用無(wú)血清的培養(yǎng)基將Matrigel以1:5稀釋后加入到孔徑為8.0μm的tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細(xì)胞懸液（5×105 cells/ml），下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導(dǎo)劑，孵箱中孵育48小時(shí)后取出，用無(wú)菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經(jīng)固定、染色后封片，鏡檢10個(gè)高倍視野（400x）。
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13、、統(tǒng)計(jì)分析
　　 每個(gè)試驗(yàn)驗(yàn)證了三次，所有組別之間的統(tǒng)計(jì)分析用的是SPSS11.5，Western-blot和RT-PCR的灰度值分析用的是方差分析LSD檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、Western-blot結(jié)果顯示：肺癌細(xì)胞及正常支氣管上皮HBE僅表達(dá)p120ctm 1、3亞型；核漿蛋白抽提后發(fā)現(xiàn)：相應(yīng)細(xì)胞核漿中均有二個(gè)亞型的表達(dá)：免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)：僅p120ctn 3亞

14、型可以沉降下來(lái)Kaiso，p120ctn 1 亞型卻未能成功沉降Kaiso。
　　 2、核漿蛋白抽提后Western-blot結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)p120ctn 3亞型（p120-3A）后，與空轉(zhuǎn)染組相比出現(xiàn)了細(xì)胞漿中Kaiso的量增加（P<0.05），細(xì)胞核中的量減少（P<0.05）的現(xiàn)象；而過(guò)表達(dá)p120ctn 1亞型（p120-1A）Kaiso的核漿表達(dá)量與空轉(zhuǎn)染組相比沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。
　　 3、施加萊普

15、霉素后核漿蛋白抽提、Western-blot的結(jié)果顯示：施加萊普霉素的過(guò)表達(dá)p120-3A與未施加的相比，部分p120ctn 3亞型被阻滯于細(xì)胞核內(nèi)（P<0.05），同時(shí)Kaiso的核漿再分布也被終止。萊普霉素也同樣阻滯了部分p120-1A的出核，但對(duì)于Kaiso的核漿分布沒(méi)有影響。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)Kaiso后，Kaiso下游候選靶基因MMP-7和MTA2明顯下調(diào)（P<0.05）；過(guò)表達(dá)p120-1A和p

16、120-3A均上調(diào)了MMP-7和MTA2的mRNA水平（P<0.05），但過(guò)表達(dá)p120ctn 1亞型上調(diào)的程度強(qiáng)于過(guò)表達(dá)p120ctn 3亞型。
　　 5、應(yīng)用饑餓誘導(dǎo)，PMA及其抑制劑BisI處理細(xì)胞后核漿蛋白抽提、Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示：p120ctn 3亞型的絲氨基酸的288位點(diǎn)饑餓誘導(dǎo)磷酸化后增強(qiáng)了與Kaiso蛋白的結(jié)合，并增強(qiáng)Kaiso的出核量，同時(shí)增強(qiáng)上調(diào)MMP-7和MTA2的mRNA水平；PMA誘導(dǎo)

17、288位點(diǎn)的去磷酸化可以逆轉(zhuǎn)上述作用。
　　 6、免疫熒光F-actin染色和基質(zhì)膠侵襲transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：p120蛋白的入核和絲蘇氨基酸位點(diǎn)的磷酸化均可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞伸出偽足和形成侵襲邊緣，磷酸化后穿入transwell小室的癌細(xì)胞明顯增多（P<0.05）。
　　 結(jié)果：
　　 1、核漿穿梭的p120ctn 3亞型與核漿穿梭的Kaiso直接結(jié)合
　　 2、核漿穿梭的p120ctn 3亞型協(xié)助