2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
   通過細(xì)胞內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察P21活化的蛋白激酶2(PAK2)磷酸化原癌基因蛋白c-Jun對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響,闡明PAK2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,探討PAK2作為腫瘤治療新靶點(diǎn)的可能性,為惡性腫瘤治療提供新的思路和方法。
   方法:
   1.利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平。
   2.利用sh-RNA技術(shù)使小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)以及人黑色素瘤SK-ME

2、L-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown),觀察其對(duì)細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)化和AP-1活性的影響。
   3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察不同處理因素條件下對(duì)細(xì)胞增值的影響。
   4.Soft-agar克隆實(shí)驗(yàn)(anchorage-independent cell transformation assay)分析小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi),人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響;小鼠

3、上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)被突變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-C-Jun)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。
   5.轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用AP-1活性檢測(cè)方法觀察小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi),人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響;JB6細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)被突

4、變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-c-Jun)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響;JB6細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAK2和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun),pcDNA3.1-PAK2和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)被突變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-c-Jun)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響。
   6.應(yīng)用哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)(Mammalian two-hybri

5、d assay)觀察PAK2和c-Jun是否能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
   7.體外PAK2激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(PAK2 kinase assay)觀察有活性的PAK2激酶是否能結(jié)合并磷酸化全長(zhǎng)的c-Jun蛋白;觀察有活性的PAK2激酶磷酸化全長(zhǎng)的c-Jun蛋白是在絲氨酸位點(diǎn)還是蘇氨酸位點(diǎn)。
   8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitation)觀察外源性的PAK2和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)是

6、否能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
   9.c-Jun肽段圖分析(c-Jun piptides mapping)檢測(cè)c-Jun蛋白能夠被PAK2磷酸化的蘇氨酸位點(diǎn)。
   結(jié)果:
   1.利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平結(jié)果:
   ①表皮生長(zhǎng)因子EGF能活化PAK2,在EGF(10ng/ml)處理15分鐘后后,能看到PAK2被活化,隨著EGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng),PAK2的磷酸化水平顯示出逐

7、漸增強(qiáng)的趨勢(shì),在EGF刺激3小時(shí)后PAK2出現(xiàn)最強(qiáng)的磷酸化活性。同時(shí),由EGF誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。
   ②在穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞系中用EGF(10ng/ml)于不同時(shí)間點(diǎn)刺激條件下檢測(cè)了一些蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,與對(duì)照組sh-mock相比,在PAK2表達(dá)下降穩(wěn)定細(xì)胞系中,所有被檢測(cè)的蛋白表達(dá)水平(p-ERK1/2,ERK1/2,p-RSK,RSK,p-c-Jun(Ser6

8、3),pr-c-Jun(Ser73),c-Jun,c-Fos)都沒有改變。
   ③在J86細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)質(zhì)粒和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)被突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)質(zhì)粒,建立穩(wěn)定細(xì)胞系,在穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(p

9、cDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞中,我們檢測(cè)到xpress標(biāo)簽以證實(shí)pcDNA4-wt-c-Jun和pcDNA4-mut-c-Jun已被成功的轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞。
   ④在小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞,人皮膚角質(zhì)Hacat細(xì)胞,人黑色素瘤SK-MEL-5和SK-MEL-28細(xì)胞中檢測(cè)了PAK2蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示出PAK2在人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEK-5和SK-MEK-28中是高表達(dá)的。
   2.利用s

10、h-RNA技術(shù)使小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)以及黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown)的結(jié)果。
   ①在JB6細(xì)胞中感染sh-PAK2病毒載體建立穩(wěn)定細(xì)胞系,阻滯了90%的內(nèi)源性的PAK2蛋白的表達(dá)。
   ②在人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞中感染sh-PAK2病毒載體建立穩(wěn)定細(xì)胞系,阻滯了大約80%的內(nèi)源性的PAK2蛋白的表達(dá)。
   3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
   ①比

11、較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞的增殖曲線,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞的增殖明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
   ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖曲線,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T

12、8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖明顯低于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
   ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞的增殖曲線,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞的增殖明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL

13、-5細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
   4.Soft-agar克隆實(shí)驗(yàn)(anchorage-independent cell transformationassay)結(jié)果。
   ①比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù),結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯的少于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克

14、隆數(shù)(P<0.05)。
   ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù),結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯

15、的少于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)(P<0.05)。
   ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù),結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯的少于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-aga

16、r中產(chǎn)生的克隆數(shù)(P<0.05)。
   5.轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性(AP-1 activity)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
   ①比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞的AP-1活性,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞(P<0.05)。
   ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-

17、mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的AP-1活性,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞(P<0.05)。
   ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)

18、胞的AP-1活性,結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞(P<0.05)。
   ④.當(dāng)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)和pcDNA3-1-PAK2質(zhì)粒被共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞時(shí),與其它轉(zhuǎn)染組相比,AP-1的活性明顯的升高(p<0.05)。然而,當(dāng)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)

19、突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和pcDNA3.1-PAK2質(zhì)粒被共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞時(shí),與pcDNA3.1-PAK2和pcDNA4-wt-c-Jun共轉(zhuǎn)染組相比,AP-1的活性顯著降低(p<0.05)。
   6.哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)(Mammalian two-hybrid assay)結(jié)果顯示PAK2和c-jun能夠在HEK293細(xì)胞中結(jié)合,當(dāng)pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共轉(zhuǎn)染時(shí),其lu

20、ciferase的活性大約是對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染pG5lu)的35倍高;pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共轉(zhuǎn)染組作為陽(yáng)性對(duì)照,其luciferase的活性大約是對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染pG5lu)的65倍高。
   7.體外激酶活性檢測(cè)(PAK2 kinase assay)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
   ①.PAK2能夠在細(xì)胞外結(jié)合并磷酸化c-Jun.
   ②.PAK2能夠在蘇氨酸位點(diǎn)強(qiáng)烈的磷酸化c-Jun,而不能在絲氨酸位點(diǎn)

21、磷酸化c-Jun,包括兩個(gè)著名的位點(diǎn)絲氨酸63(Ser63)和絲氨酸73(Ser73)。
   8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitation)結(jié)果顯示:外源性的PAK2和野生型c-Jun轉(zhuǎn)入細(xì)胞后,V5標(biāo)簽的PAK2被V5抗體結(jié)合并被beads共沉淀,c-Jun蛋白能夠隨著PAK2的沉淀被免疫共沉淀,這說明PAK2和c-Jun在細(xì)胞內(nèi)能夠結(jié)合。
   9.c-Jun肽段圖(c-Jun piptides ma

22、pping)分析檢測(cè)結(jié)果:
   ①.T2,T8,T89,T93,T286五個(gè)位點(diǎn)信號(hào)較強(qiáng),T91,T126,T231三個(gè)位點(diǎn)沒有信號(hào),表明PAK2磷酸化c-jun在五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)。
   ②.有活性的PAK2激酶與不同位點(diǎn)突變的全長(zhǎng)的c-Jun蛋白在細(xì)胞外反應(yīng)顯示,只有五個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變(T2,T8,T89,T93,T286),PAK2才不能磷酸化c-Jun。
   結(jié)論:

23、
   1.在小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞中及人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞中感染(infect)sh-PAK2病毒載體,建立穩(wěn)定細(xì)胞系,使PAK2表達(dá)下降,阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化,同時(shí)AP-1活性下降。
   2.c-Jun的五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T93,T286)同時(shí)突變后,阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化,同時(shí)AP-1活性下降。
   3.PAK2能結(jié)合并磷酸化c-Jun在五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2,T8,T89,T

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